摘 要

羰基还原酶能够催化潜手性羰基化合物合成手性醇。手性醇可作为多种重大药物合成的重要中间体，在精细化学品和药物合成上有重要应用。筛选新的高选择性高活性的羰基还原酶具有重要的意义。

本实验以苯乙酮作为底物，对实验室菌种库中保藏的15株菌株进行转化活性筛选，通过全细胞催化与转化的方法，采用气相进行检测，得到了能够转化200 mM底物苯乙酮的LS-2菌株。该菌株能够催化转化苯乙酮生成苯乙醇，转化率较好，培养条件为：静息细胞，培养时间12 h，培养温度37 ℃。反应条件为：菌体浓度0.2 g/mL，反应浓度2 mM，反应转速1000 rpm，反应温度37 ℃，反应时间12 h。

关键词：手性醇，羰基还原酶，生物转化，筛选

Screening of Microorganisms for Biocatalytic Reduction of Carbonyl Compounds

Abstract

Carbonyl reductase can catalyze the synthesis of chiral alcohols from latent chiral carbonyl compounds. Chiral alcohols can be used as important intermediates in the synthesis of many important drugs and have important applications in fine chemicals and drug synthesis. Screening new carbonyl reductases with high selectivity and activity is of great significance.

In this experiment, 15 strains of acetophenone were screened for transformation activity in the laboratory strain bank. Through whole cell catalysis and transformation, LS-2 strain capable of transforming 200 mM acetophenone was obtained by gas phase detection. The strain can catalyze the transformation of acetophenone to phenylethanol, and the transformation rate is good. The culture conditions are: resting cells, culture time 12 hours, culture temperature 37 C. The reaction conditions were as follows: bacteria concentration 0.2 g/mL, reaction concentration 2 mM, reaction speed 1000 rpm, reaction temperature 37 C, reaction time 12 h.

Key words: chiral alcohols, carbonyl reductase, biotransformation, screening

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 引言 1

1 .1手性 1

1.1.1 手性简介 1

1.1.2 手性药物 1

1.1.3 手性醇及其应用 1

1.1.4 手性醇的合成 2

1.2 生物催化 3

1.2.1 生物催化的定义 3

1.2.2 生物催化的优点 4

1.2.3 生物催化剂 4

1.2.5 生物催化剂的应用 4

1.2.6 生物催化技术产品 5

1.3 羰基还原酶 5

1.3.1 羰基还原酶简介 5

1.3.2 羰基还原酶的分类 5

1.3.3 羰基还原酶的发现 6

1.3.4 羰基还原酶的催化机理 6

1.4 研究意义及内容 7

1.4.1 研究意义 7

1.4.2 研究内容 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 材料与仪器 8

2.1.1 实验材料 8

2.1.2 实验试剂 9

2.1.3 实验仪器 9

2.2 培养基的配制 10

2.2.1 倒平板 11

2.3 菌种的培养 11

2.4 菌种的保藏 11

2.5 底物苯乙酮溶液的配制 11

2.6 30%甘油保藏液的配制 12

2.7 PB（pH=7.4）缓冲液的配制 12

2.8 羰基还原酶催化活性的鉴定 12

2.8.1 生长细胞催化苯乙酮还原反应 12

2.8.2 静息细胞催化苯乙酮还原反应 13

2.9 底物苯乙酮标准溶液的配制 13

2.10 产物苯乙醇标准溶液的配制 14

2.11 气相检测方法 14

第三章 结果与讨论 15

3.1 菌种鉴定结果 15

3.1.1 菌落基本特征 15

3.2 气相检测结果 16

3.2.1 底物苯乙酮标准品气相色谱图 16

3.2.2 底物苯乙醇标准品气相色谱图 16

3.2.3 样品气相色谱图 17

第四章 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致谢 24

第一章 引言

1 .1手性

1.1.1 手性简介

手性（chirality）包含于整个自然界内，能对实际对象对称性进行说明^[1]。对于特定对象，若其和自身的镜像存在一定的差异，则可以说明是具有“手性的”，此时，对象的镜像同原物处于非重合状态，类似于人的左右手，彼此是不能很好叠合^[2]。需要说明的是，对于手性类型的物体，其自身同镜像被统一叫做对映体，（enantiomorph），而针对分子等相关说明，一般叫做对映异构体^[3]。根据该原理，如果物体同镜像是能够进行重合的，则通常将该物体是非手性的(achiral)。

1.1.2 手性药物

手性药物是将手性分子嵌入到药物结构分子中得到的对映异构体。根据美国Technology atalysts公司统计的数据来看，世界手性药物市场1993年总额为356亿美元，增长速度每年20%以上，2002年达到了1520亿美元，占同年药品市场总额的37%，随着手性技术的发展来看，手性药物将占总药物的80%^[4]。

手性药物相对于常规药物有以下优势：疗效高、毒副作用小、用药量少，这些优势使手性药物成为未来新药的发展方向。需要强调的是，尽管国内在手性药方面发展存在较好的基础，然而对比国外先进技术，差距较为明显，必须要进行大力开发，如今，针对更好的发展国内自身的手性药和合成方法，已经是生物医药等相关领域需要攻克的重中之重。

1.1.3 手性醇及其应用

该类醇属于一类旋光化合物，其中的羟基可被其它不同功能的基团替换，使手性醇的性质发生不同程度的改变^[5,6]。