论文总字数：20522字

摘 要

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1斑马鱼的简介 1

1.1.1斑马鱼在肿瘤研究中的应用 1

1.1.2 斑马鱼在毒理学研究中的应用 1

1.2金诺芬的临床应用 2

1.2.1 治疗类风湿性关节炎 2

1.2.2 抗肿瘤 2

1.3.1 血管生成 3

1.3.2 血管生成抑制剂 3

第二章 金诺芬的抗血管新生活性研究 5

2.1引言 5

2.2 实验材料和方法 5

2.2.1 细胞株 5

2.2.2 斑马鱼的饲养 9

2.2.3 主要试剂和耗材 10

2.2.4 主要仪器 11

2.2.5 cck-8细胞增殖活力检测实验 12

2.2.6细胞迁移实验 13

2.2.7小管形成实验 14

2.2.8 斑马鱼实验 15

2.2.9 数据分析 15

2.3实验结果与讨论 15

2.3.1 cck-8细胞增殖活力检测实验结果 15

2.3.2 细胞迁移实验结果 16

2.3.3 小管形成实验结果 17

2.3.4 斑马鱼实验结果 18

2.3.5 讨论 20

第三章 总结与展望 21

3.1 结论 21

3.2 展望 21

摘 要

据《中国健康报》在世界癌症日的报道，我国癌症患者每年新增近200万，死亡约150万，癌症已成为我国人口死亡的主要原因之一。化疗是目前治疗癌症的主要方法，但疗效不尽如人意，主要是化疗药物存在无选择性、毒副作用大、体内代谢快、治疗指数低等缺点，且化疗过程中产生的多药耐药(multi-drug resistance，MDR)常常导致癌症化疗达不到预期效果。

尽管抗细胞增殖药物可以杀死肿瘤细胞，但由于周围血管的支持，残存肿瘤细胞仍可获得血供而得以继续生长。而金诺芬作为治疗风湿病的药类，其也能通过抗血管的生成来抗肿瘤， 是一种全新的靶向治疗策略。 但是目前对金诺芬抗肿瘤的研究不是很广泛，希望以后可以有更多的学者做此研究，创造更好更有效毒副作用最小的新型药物。

本研究在实验室前期筛选的基础上,选定临床抗风湿药金诺芬(Auranofin, Aur)通过体内体外实验,研究其能抗血管从而抗肿瘤作用,并初步探讨增敏作用产生的机制,为两类药物的临床联合应用提供实验依据。此研究就是金诺芬通过抗血管生成来抑制肿瘤，是一种全新的靶向治疗策略。斑马鱼是是一种理想的抗血管生成药物的筛选模型，是一种用于研究脊椎动物胚胎学和发育遗传学的模式生物。它具有体积小、生殖周期短、生殖能力强、体外受精且胚胎发育透明、其基因与人类基因的相似度达到87％等特点。而金诺芬通过斑马鱼的筛选模型研究，从而看是否能抑制肿瘤新生血管生成，是否能持续抑制肿瘤细胞的生长和转移。

关键词：金诺芬 斑马鱼 血管生成 肿瘤

ABSTRACT

Drug-induced liver injury has been recognized as a major cause of attrition during both the early and later stages of the drug development and marketing process. Reducing or eliminating drug-induced hepatotoxicity would be tremendously beneficial for patients. Conventional in vitro cytotoxicity assays have less than 25% sensitivity for the detection of hepatotoxins, whereas in vivo assessment of organ toxicity frequently involves full histopathological analysis in rodents or higher order species such as Macaque monkeys that are very laborious, costly and time-consuming. Given the current low productivity of pharmaceutical companies and the high costs of bringing new medicines to market, any plate supported by nutrients stored in the yolk. Test drugs can be simply dissolved infish water and zebrafish larvae absorb small molecules diluted in the surrounding water through their skin, gut and gills. Highly hydrophobic compounds, large molecules and proteins can be injected into the yolk sac, the sinus venosus or the circulation.Compared to testing in other animal models, statistically significant numbers of zebrafish can be used for each assay and small amounts(mg) of drug are required. Additional advantages for using larval zebrafish include small size, easy maintenance and breeding and

high productivity. Use of zebrafish as an alternative animal model for drug screening can greatly accelerate the drug discovery process, decrease costs, and provide more accurate results than cell-based assays.

Keywords: Auranofin zebrafish angiogenesis cancer

第一章 文献综述

1.1斑马鱼的简介

1.1.1斑马鱼在肿瘤研究中的应用

斑马鱼是一种用于研究脊椎动物胚胎学和发育遗传学的模式生物。它具有体积小、生殖周期短、生殖能力强、体外受精且胚胎发育透明、其基因与人类基因的相似度达到87％等特点。近年来，斑马鱼作为一种模式生物，已经广泛应用研究及其前景做一综述。用于人类疾病模型的建立。本文就斑马鱼作为一种肿瘤研究模式生物所具有的优势、是一种理想的抗血管生成药物的筛选模型。有研究发现血管荧光标记的转基因斑马鱼可用来快速筛选抗血管生成药物,认为其有潜力成为一种高通量筛选模型。一些抗血管生成药物作用于斑马鱼的效果与在哺乳动物中的相近,证实了利用斑马鱼筛选抗血管生成药物的有效性。

最近出现的几种斑马鱼疾病感染模型为新型抗微生物药物的开发提供了新的模型。与小鼠模型相比，使用斑马鱼可以实时追踪病原侵染过程，更好地理解发病机理，且同样具有病原菌感染的先天和获得性免疫，并可能达到高通量筛选。

1.1.2 斑马鱼在毒理学研究中的应用

在脊椎动物遗传和发育毒理学研究方面，斑马鱼已逐渐成为最受关注的动物模型。斑马鱼的卵体透明，胚胎发育快，心脏体节清晰，给遗传操作和人工诱变提供了极为有利的条件。由于胚胎完全透明，可视性好，即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细胞。荧光染色或使用其它标记物可使细胞系观察得更清楚。另外由胚胎在体外受精、体外发育，故可在母体外对胚胎进行独立操作。

在环境毒理学研究中，自20世纪70年代末起，斑马鱼已用于环境中许多化学物的累积效应的研究。20世纪90年代初，斑马鱼开始被用于混合化学物的检测及其中一种化学物相对其它化学物的生物累积效应的研究。利用斑马鱼对一系列环境毒物包括致癌物进行短期及长期的暴露效应研究都比较方便。环境毒物的慢性生物学效应鉴定可使用斑马鱼的整个生生长抑制情况、生殖毒性以及发育命周期试验以检测死亡率、毒性和神经行为毒性。

在病理毒理学研究中，利用斑马鱼作为人类疾病的动物模型，为研究相关的病理毒理学提供了有利的方法。斑马鱼的克隆非常简便，通过适当的基因学操作可用于单倍体、三倍体和四倍体的研究。斑马鱼突变体有助于阐明毒物引起疾病的发病机制中一些特异性基因及其相关的信号传导通路的变化。

在药物毒理学研究中，应用斑马鱼评估了许多临床用药的一般毒性包括：LD₅₀、致畸作用、器官和发育毒性。研究发现斑马鱼对药物毒性作用呈现出与哺乳动物可比的反应，同时也证明了斑马鱼的胚胎为研发药物作用提供了一个新的独特的途径。还进行了一系列药物的特异性毒性试验如血.管发生、神经毒性、肝毒性、软骨发育、生殖毒性、发育毒性、肿瘤发生等。

1.2金诺芬的临床应用

1.2.1 治疗类风湿性关节炎

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA) 是一种病因不明的自身免疫性疾病，多见于中年女性，我国患病率约为 0.32-0.36%。主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎。关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。

金诺芬通过抑制T.B淋巴细胞，巨噬细胞活化，减少免疫球蛋白而使RF.ESR.CRP等下降。抑制关节腔内的金属蛋白酶。会伴随皮疹，肾毒性，消化道症状，血小板减少等副作用。

1.2.2 抗肿瘤

恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一。而抗肿瘤血管生成成为一种全新的靶向治疗策略。尽管抗细胞增殖的药物可以杀死肿瘤细胞，但由于周围血管的支持，残存肿瘤细胞仍可获得血供而以继续生长。同时，异常的肿瘤血管使药物向肿瘤组织内部递送减少，最终导致抗细胞增殖治疗的疗效受限。 与仅作用于肿瘤细胞增殖的化疗药物不同，通过与VEGF特异性结合，阻止其与受体

相互作用，发挥对肿瘤血管的多种作用：使现有的肿瘤血管退化，从而切断肿瘤细胞生长所需氧气及其他营养物质；使存活的肿瘤血管正常化，降低肿瘤组织间压，改善化疗药物向肿瘤组织内的传送，提高化疗效果；抑制肿瘤新生血管生成，从而持续抑制肿瘤细胞的生长和转移。 而金诺芬近年来，通过研究发现其有抗血管生成的一方面的作用，从而为恶性肿瘤的病人带来了福音。

1.3.1 血管生成

血管生成（angiogenesis）是从已有血管发芽生成新血管的过程。这一过程与血管内皮细胞迁移和增殖相关。胚胎发育过程伴随着血管生成（angiogenesis）。但除了伤口愈合、女性经期及一些病理过程（如癌症）外，成人很少出现血管生成（angiogenesis）。血管生成对恶性实体肿瘤的生长、转移乃至预后都有着极其重要的意义。目前国内在研究肿瘤中新生血管时，常用的血管内皮细胞标记物包括CD34 、CD31、CD105等。

血管生成是恶性实体肿瘤突破上皮基底膜后进一步生长所必须的。肿瘤中新形成的血管具有其自身独特的结构特点,表现为管壁不完整,无平滑肌成分,仅由有孔的内皮细胞和片状的基膜构成。多数学者认为,新生血管的结构特点使恶性肿瘤组织发生远处转移成为可能。因此,恶性实体肿瘤中新生血管的定量被认为是一种重要的独立的预后标志。

1.3.2 血管生成抑制剂

1.3.2.1 抑制基底膜降解的药物
该类抑制剂可以与金属蛋白酶的锌指结构结合而抑制其活性，从而防止细胞外基质的降解和基底膜的破坏，抑制肿瘤血管生成。目前有天然的基质金属蛋白酶（MMP）抑制物，如neovastat;人工合成的MMP抑制物，如Marimastat（BB2516）、AG-3340等。马立马司他（Marimastat，BB2516）是第1个用于治疗肿瘤并已进入各期临床实验的MMP抑制药。

1.3.2.2 直接抑制内皮细胞的药物
该类抑制剂直接作用于内皮细胞，抑制内皮细胞的增殖和（或）促进其凋亡。O-（氯乙酰-氨甲酰基）烟曲霉醇即TNP-470，是烟曲霉素的半合成类似物，可以抑制多种血管内皮细胞，对正常体细胞没有影响，并因其高效低毒颇受人们关注。现已广泛的投入到对乳腺癌、结肠癌、肾癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的临床实验中。36例晚期肿瘤患者经TNP-470治疗后肿瘤的生长不同程度的受到抑制，生存期延长 。血管抑素具有特异性抑制血管内皮细胞增殖的作用，Moser等发现血管抑素可与血管内皮细胞表面的ATP合酶α/β亚单位结合，抑制其活性，从而抑制血管生成。

1.3.2.3 抑制血管生成因子活化的药物
该类抑制剂通过选择性地抑制一种或几种血管生成因子或通过阻断其受体而发挥作用。VEGF能够特异性地刺激血管内皮细胞增殖和血管生成，增加血管通透性，因此是血管治疗中的主要靶分子。抗VEGF单克隆抗体可以直接抑制VEGF。Borgstrom等研究发现，抗VEGF抗体可抑制前列腺癌的新生血管形成，并且抑制肿瘤生长。 BSU5416是VEGF受体Flk-1/KDR酪氨酸激酶的抑制物，对bFGF、PDGF、VEGF等因子都有抑制作用。I期临床实验提示，它对肝癌和非小细胞肺癌及脑胶质瘤有较好的疗效，目前正进行Ⅲ期临床实验。

1.3.2.4 抑制内皮细胞特异性整合素和生存信号的药物
该类抑制剂通过阻断内皮细胞表面特异性整合素可导致血管内皮细胞凋亡，破坏新生血管的形成。 Vitaxin即整和蛋白avb3人源化单克隆抗体，该抗体以avb3为抗原位点，可导致血管内皮细胞凋亡，破坏新生血管的形成，已在乳腺癌、结肠癌、肺癌及黑色素瘤患者中得到证实，现已进行临床实验。反应停能减少整合素β亚单位的表达，还可以上调一种潜在的血管生成调节蛋白―――玻基结合素前体（vitronectinprecursor）的水平，故其抗血管生成作用与血管整合素通路有关 。

1.3.2.5 其他非特异性作用机制的药物
该类抑制剂包括碳氧氨咪唑（CAI），白介素-12（IL-12），IM862等。IL-12作为一种细胞因子和免疫调节物，它对肿瘤有直接对抗作用，同时它也表现出抗血管生成的作用。

第二章 金诺芬的抗血管新生活性研究

2.1引言

随着近年来学科和新材料、新设备的发展，抗肿瘤给药系统( Antitumor drug delivery system ，ADDS) 的研发已成为制药行业发展最快的领域之一。

尽管抗细胞增殖药物可以杀死肿瘤细胞，但由于周围血管的支持，残存肿瘤细胞仍可获得血供而得以继续生长。而金诺芬作为治疗风湿病的药类，其也能通过抗血管的生成来抗肿瘤， 是一种全新的靶向治疗策略。

但是目前对金诺芬抗肿瘤的研究不是很广泛，希望以后可以有更多的学者做此研究，创造更好更有效毒副作用最小的新型药物。

2.2 实验材料和方法

1、材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，培养细胞。

2、药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，Hanks液。

2.2.1 细胞株

细胞株： 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain）。

2.2.1.1 原代细胞的培养

（1）紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

（2）将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

（3）取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。

（4）拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。

（5）将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

（6）将培养瓶放于28℃,5%CO₂的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在CO₂培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。

2.2.1.2 培养液的更换

（1）紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

(2) 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

(3) 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口。

(4) 拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放。

(5) 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

(6) 将培养瓶放于28℃,5%CO₂的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。

2.2.1.3 细胞传代

(1)紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

(2)将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

(3)将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

(4)将培养瓶平放使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s，立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的最佳消化状态。用移液器将胰酶吸净。

(5)吸取1ml培养基于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

(6)取2或3个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，然后将细胞培养基均匀的分到3或4个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传3或1传4的培养。

(7)拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基悬空移入每个培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。

(8)将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

(9)将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。

2.2.1.4 细胞株的保存

(1) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

(2)将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

(3)将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

(4)将培养使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s，立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的最佳消化状态。用移液器将胰酶吸净。

(5)吸取1ml细胞冻存液于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

(6)将1ml含有细胞的冻存液移入新的保种管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。

(7)将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

(8)将保种管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱内3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌内长期保存。

2.2.2 斑马鱼的饲养

2.2.2.1 斑马鱼的雌、雄区别

成熟的雄鱼个部位的鳍交长，颜色看起来鲜艳一点，雌鱼则相反。雌鱼成熟时肚子很大雄鱼也会不停的追它这时就可以繁殖了。用一个四十厘米左右的小盆或玻厘缸放进以点水草和小脂头大小的石子，到入三分之二的晾晒过的新鲜水和三分之一原来鱼缸里的水。放到早上能照到阳光的地方。如果是冬天可以用恒温加热管把水温调到比养鱼缸的水温高两三度。傍晚（天刚黑）时把一条雌鱼和两条雄鱼或两条雌鱼和三条雄鱼放入缸里这样就可以了。一般早上就会生卵。

2.2.2.2 养殖要领

一、水

（1）、水质

人工饲养热带鱼要求水质为软水或低硬度水，酸碱度以弱酸性或中性为好。酸性较强，热带鱼呼吸困难、生长缓慢；碱性较强，热带鱼的鳃组织会受到腐蚀。

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