论文总字数：14023字

摘 要

药物毒性和临床安全性是药物开发失败的主要因素。大量的证据表明，斑马鱼作为一个理想的脊椎动物可以用来评价药物的毒性。在药物筛选方面，斑马鱼评价系统有先天的优势：比如它的实验周期较同类而言比较短；胚胎早期透明，体型小，饲养成本低，而且药物少；溶解在水环境中的小分子物质可以通过斑马鱼皮肤和鳃直接吸收；产卵量高，可提供大量单组实验样本。

雷公藤甲紊，英文名为triptolide，TP，它又被称作雷公藤内醇酯，还可以称为雷公藤内酯醇，亦可被称作雷公藤内酯。它是活性最高的环氧化二藉内酯化合物,是从卫矛科雷公藤（属于雷公藤)Tripterygium wilfordii Hookl fl中分离得到的，是雷公藤中的主要有效成分之一。TP之所以在国内外临床上有广泛的应用，是因为它的生理活性很强，而且还具有明显的抗炎、抗肿瘤、抗生育及免疫调节作用。

一般我们评估雷公藤甲素化合物的毒性的时候，通常选用斑马鱼模型。雷公藤甲素在发育毒性中产生的畸形包括心包膜水肿，体型异常，卵黄囊变大，胸鳍消失等。我们的研究结果表明，斑马鱼模型是一个非常有用的评价药物早期毒性的模型。

关键词：毒性评价；雷公藤甲素；致畸毒性；斑马鱼

Evaluation of drug toxicity based on model animal zebrafish

Abstract

Drug toxicity and clinical safety are the main factors for drug development failure.The evidence suggests that the zebrafish as an ideal vertebrate can be used to evaluate drug toxicity.The zebrafish evaluation system has inherent advantages in drug selection.:the experimental period is short, the embryo is transparent, the body is small, the feeding is low, and the medicine is little.;the small molecules in the water environment can be absorbed directly by the zebrafish skin and gills. The amount of eggs is high, and can provide a large amount of single group of experimental samples.

Triptolide (triptolide, TP) turbulence, also called in triptolide alcohol ester, Triptolide and wilforlide. Is isolated from the Celastraceae Tripterygium triptolide Tripterygium wilfordii Hookl FL activity the highest epoxidation second by lactone compounds, is one of the main effective component in Tripterygium Wilfordii Hook.The physiological activity of TP is very strong, and has the function of anti - inflammation, anti - tumor, anti-fertility and immunity adjustment. At home and abroad, it has been widely used.

The toxicity of the compound of the Triptolide was evaluated by the zebrafish model..Triptolide in the development toxicity of abnormalities included pericardial edema, body abnormalities, yolk sac, pectoral fins, disappeared. Our results suggest that the zebrafish model is a very useful model for evaluating the early toxicity of drugs.

KEY WORDS:. Toxicity assessment；Toxicity assessment；Teratogenicity; Zebrafish

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1斑马鱼模型在生命科学研究中的应用 1

1.1.1 斑马鱼的简介 1

1.1.2 斑马鱼在毒理学研究中的应用 3

1.1.3雷公藤甲素简介 4

第二章 利用斑马鱼模型评价雷公藤甲素的致畸毒性 7

2.1 引言 7

2.2 实验材料和方法 7

2.2.1 待测化合物简介 7

2.2.2 斑马鱼的饲养 8

2.2.3 主要试剂和耗材 8

2.2.4 主要仪器 8

2.2.5 评价雷公藤甲素的致畸毒性 8

2.3 数据分析 9

2.4 结果与讨论 10

2.4.1 雷公藤甲素致畸毒性评估结果 10

2.4.3 雷公藤甲素心脏毒性评估结果 14

2.4.4讨论 14

2.4.5 结论 15

参考文献 17

第一章 文献综述

1.1斑马鱼模型在生命科学研究中的应用

1.1.1 斑马鱼的简介

1.1.1.1 斑马鱼的特性

斑马鱼( Danio rerio )，别称蓝条鱼、花条鱼、印度鱼，是分布于孟加拉国、印度、巴基斯坦等水域的一种小型热带鱼。斑马鱼很小，全长只有4CM到6CM，其形状偏向纺锤形，鱼身有数条银蓝色纵纹，大概从鳃盖后到尾末，臀鳍部纵纹的颜色和斑马鱼身体颜色相似，尾鳍比较长，形状为叉形，斑马鱼与人类基因有很大的相似性，几乎高达87%，也就是说斑马鱼的实验数据同样可以用在人体，也因如此斑马鱼受到了科学家的重视。

在药物筛选方面，斑马鱼的评价系统有先天优势，主要表现在以下几个方面：①斑马鱼的实验研究是通过整体动物的研究，来反映化合物吸收、分部、代谢与排泄的过程。②实验周期短，大部分实验能够在1~7 d内完成。③斑马鱼在受精后7 d 内全身透明，可结合活体染料、荧光跟踪、抗体、核酸探针等方法同时观察化合物对多个器官的毒性反应。④斑马鱼体型小，不仅饲养成本低，而且药物少。⑥可以结合多种给药方式：一般来说，溶解在水环境中的小分子物质可以通过斑马鱼皮肤和鳃直接吸收。⑦斑马鱼易于大量繁殖，单次产卵量高，一对斑马鱼每次可以产生100~300个受精卵，可提供大量单组实验样本，实验统计分析结果可信度高。斑马鱼能够很快成为分子发育生物学、环境毒理学等学科的模式动物，是因为它有很多优点，例如斑马鱼养殖方便，它的繁殖周期短而且产卵量大，它还能体外受精而且胚胎透明等^[1]。

1.1.1.2 斑马鱼的日常管理

当温度在24-30 ℃之间时，斑马鱼可以以最快的速度生长和繁殖^[2]。水质的优劣对斑马鱼的生长影响不大，只要水呈弱碱性即可，即pH值7- 8。在实验室养殖斑马鱼时可以用自来水，但养殖的自来水至少需要曝气1天。斑马鱼具有较高的代谢速度，在实验室养殖过程中，在水体中需充氧，是用来保证斑马鱼的正常发育。喂食方面，每次的投喂量以斑马鱼在2 min 内吃完为宜，需要每天投食2-3次。为了保证斑马鱼生长和繁殖正常，每天的鱼食，最好是活食与人工合成的饵料相结合。正在产卵的斑马鱼，需要每日至少喂一次如丰年虫之类的活食。只要饲养的条件和方式正确，斑马鱼一般很少生病。如果饲养的条件不合适，比如水质不好亦或是换水不勤， 斑马鱼会出现细菌感染，细菌感染的表现很多，有烂鳃、脱鳞、竖鳞和皮肤充血发炎等。得病的斑马鱼应该及时捞出，避免影响其他正常的斑马鱼。一般养殖过程中，我们使用的鱼网、产卵盒等必须清洗，尤其在用完后要先用去离子水洗净，然后再消毒，消毒时使用84消毒液浸泡已达到消毒的效果，最后晾干，放好，供下次使用。鱼缸每半个月清洗一次，并用75%的乙醇消毒。

1.1.1.3 斑马鱼的繁育

实验室用来做实验的斑马鱼一般是5-6月大的成熟的斑马鱼，卵生鱼类的斑马鱼，性成熟期一般在4个月左右。在适合斑马鱼繁殖的温度下，它能整年产卵。一般在饲养过程中，雌雄斑马鱼需要分开养在不同的鱼缸里，只有在繁殖产卵时，才会将雌雄斑马鱼放入产卵盒中，刚入的比例为1∶2或1∶1，为了试验结果的准确性，我们还会在产卵盒中放入假水草，这样能够辅助斑马鱼产卵。控制光照周期为黑夜/白天14∶10h。斑马鱼所产的卵直径大约在1 mm左右。由于其比重比水大，因此会沉于盒底。盒子中间有一层挡板，防止斑马鱼吞食受精卵。第二天光照开始时，斑马鱼即开始追逐产卵，产卵一般在开灯后半小时内结束。当斑马鱼产卵结束后，将同一产卵盒的斑马鱼捞出， 按照之前的雌雄分开饲养方法继续饲养。一般来说，产过卵的斑马鱼需要与未产卵的分开，而且至少需要休息一天才能够再度产卵，这样能够避免连续捞同一条鱼进行产卵，。

用直径大于鱼卵的一次性塑料吸管吸出产卵盒底部的受精卵，将吸出的受精卵以及各污物一同放入烧杯中，将污物及发白的死卵吸出，洗好的卵放入0.2 g/L的海盐水中，并放入28.5 ℃的恒温培养箱中培养。

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