论文总字数：18963字

摘 要

饱和突变作为一种重要的改造蛋白质^[1]的手段在蛋白酶定向进化中具有重要的应用。针对特定氨基酸位点构建高质量的多样性文库能够减少后续筛选的工作量，提高筛选效率。常规的NNN或者NNK这两种简并引物使用64或者32种密码子来编码20种氨基酸，通常都会含有冗余密码子以及终止密码子，导致饱和突变文库多样性降低。最近已有报道通过设计混合简并引物实现用20种密码子来编码20种氨基酸，进而降低甚至消除冗余密码子，提高了筛选效率。

本课题主要针对NNN或者NNK两种简并引物在构建饱和突变文库方面的差别进行研究。对通过这两种方法构建的突变文库多样性进行初步评价，确定各个方法的优劣。苯丙酮单加氧酶在本实验中将作为模式酶，突变靶位点为R337。

关键词：定向进化 饱和突变 简并引物

Protein directed evolution in the saturated mutant library building methods of research

Abstract

Saturated mutations as an important means of mutations in the protein orientation plays an important role in the evolution.For a specific amino acid sites to build high quality diversity mutant library can reduce the subsequent selection work and improve the filtering efficiency.In the purpose of amino acid sites design degenerate primer PCR amplification carried out on the purpose gene may be mutant which contains 20 kinds of amino acids.Conventional NNN or NNK degenerate primers using 64 or 32 kinds of codes to encode 20 kinds of amino acids, usually contain redundant codes and termination codon.Recently it has been reported that 20 kinds of amino acids encoded by mixed degenerate primers designed with 20 kinds of codes,reduce or even eliminate the redundant codes,to improve the efficiency of filtering.

This topic of the two kinds of degenerate primers design method which have been reported and conventional NNN or NNK degenerate primers are compared in the same conditions.By means of different methods was used to construct the preliminary evaluation of the mutant library diversity, determine the advantages and disadvantages of each method.Baeyer-Villager will be a model enzyme in this experiment.

Keywords: directed evolution; A saturated mutant; Degenerate primers

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 定向进化技术的发展与应用 1

1.2 饱和突变发展历史 1

1.2.1 定点突变技术 1

1.2.2 饱和突变技术 2

1.3 PCR技术的发展 2

1.3.1 PCR简介 2

1.3.2 PCR原理 3

1.3.3 PCR发展 3

1.4 蛋白质饱和突变突变文库的构建方法 3

1.5研究意义 3

1.5.1 研究意义 3

1.5.2 研究内容 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1引言 5

2.2 实验材料与方法 5

2.2.1 实验材料 5

2.2.2 实验试剂 5

2.2.3 实验仪器 6

2.2.4 实验准备 7

2.2.4.1 培养基制备 7

2.2.4.2 大肠杆菌感受态细胞制备 8

2.2.4.3 抗生素的配制 9

2.3 电转化 10

2.4 提质粒 10

2.5 琼脂糖凝胶电泳 11

2.6 PCR扩增 12

2.6.1 引物配制 12

2.6.2 反应液配制（50μl体系） 12

2.6.3 PCR反应条件 12

2.6.4 Dpn I消化（去模版） 13

2.6.5 转化 13

2.6.6提质粒测序 13

2.7 结果与讨论 14

2.7.1 PAMO经过转化、涂板、接种、培养、提质粒。琼脂糖凝胶电泳图如下 14

2.7.2 PAMO经PCR过后的产物。琼脂糖凝胶电泳图如下 14

2.7.3 PAMO经PCR突变后进行纯化，再转化、涂板、接种、培养、提质粒。 14

2.7.4 通过测序分析构建的NNN和NNK文库中密码子的多样性 15

2.7.5 本次实验的不足以及改进方向 16

2.8 本章小结 16

第三章 结论与展望 17

3.1 结论 17

3.2 展望 17

参考文献 18

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 定向进化技术的发展与应用

定向进化为了改造遗传的多样性，已经在实验室进行了大量的实验，利用与相应的文库参照使用进行高通量的筛选去得到理想性状生物体，现已成为了应用生物学和基础生物学这些领域中应用最广泛有效的技术之一。它不再需要知道酶的一些讯息比如结构以及功能等这些方面，它利用基因重复多轮的突变以及重组来建立对应的多样性文库，再利用筛选手段并结合文库从大量的突变后代中鉴别性能改善的突变体^[2]。

当前，定向进化策略的研究难题依旧还是在于天然蛋白如何引进新功能上，它主要体现在下面两个方面：（1）蛋白质新功能的引进通常需要一连串的突变、重组过程协同发生作用，但根据现况，大多数定向进化技术方法，比如易错PCR，DNA shuffling等常用的技术，都只局限于少数氨基酸发生突变^[3]；使用定向进化技术来改造蛋白质去获得新功能就要对蛋白质初始的序列进行大幅度的改造，大量无活性蛋白就会在建立的突变文库中产生，增大了筛选的难度^[4]。

最初的定向进化技术大多都是以单个蛋白为标靶，为了达到工业化的要求，我们使用随机突变或定点突变两种方法，得到稳定效果更强及催化活性更高的新型突变酶。近几年来，人开始改造代谢途径或者是基因组方面，为了能够发现新型全细胞催化剂去合成价值更高的生物产品^[5]。

请支付后下载全文，论文总字数：18963字