论文总字数：18322字

摘 要

纳米小分子水凝胶是一种新颖的制剂，与传统水凝胶制剂相比具有更好的生物相容性和生物可降解性。本文设计一类可自组装的寡肽生物水凝胶作为蛋白药物输送的载体。将氨基酸类生物小分子作为凝胶前体，并采用生物大分子酶为触发器，催化凝胶前体形成寡肽凝胶因子，从而自组装形成凝胶，用于包载蛋白药物。考虑到酶和蛋白间可能发生相互作用，我们采用自由基聚合反应在蛋白表面形成保护。

本文以重组菌WB600-pMA5/aprWQ表达出高纯度生物大分子酶WQ9-2，酪蛋白水解法测定催化活性为17078.659 U。以凝胶前体Fmoc-Leu与Leu-Phe为自组装模块，采用蛋白酶催化法缩合肽键，催化制备小分子水凝胶。

同时，选用牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）为模型蛋白，对其进行修饰。固定单体，连接臂，催化剂比例为80：80：64，制备不同粒径大小的蛋白纳米胶，后单因素考察（单体，连接臂）对蛋白模型药物BSA的修饰进行了研究。通过优化BSA的修饰条件，BSA的粒径从1.29 nm增长到7.531 nm，同时，电位从-13 mV翻转到了2.45 mV。证明成功制备了BSA蛋白纳米胶。

关键词：小分子水凝胶 纳米级 WQ9-2 BSA正电荷修饰

The Synthesis and Characterization of medicinal Bio-nanogel

Abstract

Small Molecular Nanotechnology is a novel hydrogel preparation, as compared with the conventional hydrogel formulations have better biocompatibility and biodegradability.This design for a class of self-assembling biological oligopeptide hydrogel as a carrier protein drug delivery. The amino acids in biological small molecules as gel precursor, and the use of biological macromolecules forming enzyme oligopeptide gel as a trigger factor, catalytic-gel precursor, thereby fo- rming a self-assembled gels for entrapping protein drugs. Taking into account the possible interactions between the enzyme and protein, we have adopted a radical polymerization reaction in the protein surface protection.

In this paper, Bacillus cereus (Bacillus cereus WQ9-2) (expressed high purity biological macromolecules enzyme WQ9-2, and catalytic activity of casein hydrolysis is 17078.659 U. Fmoc-Leu and Leu-Phe are used as self-assembling module, while the protease catalytic method is used for condensing a peptide bond to catalytic the hydrogel preparation.

At the same time, the choice of BSA (bovine serum albumin, BSA) as model protein and its modification. The ratio of fixed monomer, a linker arm and cat-alyst is 80:80:64.Preparation of different particle size of the protein nano-glue after single factor (single, connecting arm) model drug BSA protein modification were studied. By optimizing the BSA modified conditions, BSA particle size of from 1.29 nm to 7.531 nm, the potential of -13 mV flipped to 2.45 mV. We proved successfully prepared BSA protein nanogel.

Key Words: Nanogel; Nanoscale; Bacillus cereus WQ9-2; Positive charge modified BS

目 录

摘要 I

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 抗肿瘤药物介绍 1

1.1.1化疗药物介绍 1

1.1.2 蛋白类药物介绍 2

1.2 小分子水凝胶 3

1.2.1细胞黏附性水凝胶 3

1.2.2 纳米水凝胶的体外表征 4

1.3本课题所研究的目的及其意义 5

第二章 蛋白酶的表达及水凝胶的制备 6

2.1前言 6

2.2实验材料 6

2.2.1 菌株与质粒 6

2.2.2 实验试剂 7

2.2.3 主要设备及仪器 7

2.2.4培养基 8

2.3 实验方法（WQ9-2表达） 9

2.3.1 WQ9-2的发酵培养和种子培养液的制备 9

2.3.2 大分子蛋白胶的制备以及电泳条件 9

2.3.3蛋白酶活力的测定（酪蛋白水解法） 10

2.3.4水凝胶的制备 10

2.4 结果与讨论 10

2.4.1蛋白酶WQ9-2的表达 11

2.4.2水凝胶 11

2.5 本章小结 12

第三章 模型药物的选择：蛋白模型BSA 13

3.1 前言 13

3.2 实验材料 13

3.2.1 实验试剂 13

3.2.2 实验仪器 14

3.3 实验方法 14

3.3.1 BSA和WQ9-2蛋白酶共孵 14

3.3.2正电荷包裹BSA 14

3.4 结果与讨论 16

3.4.1 WQ9-2与BSA共孵 16

3.4.2 正电荷包裹BSA 17

3.5 本章小结 19

第四章结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 24

第一章 文献综述

1.1 抗肿瘤药物介绍

临床上抗肿瘤药物可分为小分子化疗药物、蛋白类药物、细胞因子类、细胞分化剂类、单克隆抗体类。在这之中，化疗药物是一种通过干扰核酸生物而合成的药物，它可以直接影响DNA的结构以及DNA功能的一类药物。化疗药物可以干扰转录的过程并且阻止RNA合成的药物^[1]，它由放线菌素D(又名更生霉素或者DACT)、阿霉素（又名多柔比星）、红卫霉素（又名柔红霉素）和抑制蛋白质合成以及功能的药物所组成。

1.1.1化疗药物介绍

化学疗法是肿瘤治疗的常规疗法，通常化疗药物根据来源和结构可分为烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢药、激素和免疫制剂。其中最常使用的药物为阿霉素（DOX）和紫杉醇（PTX）。

阿霉素（Doxorubicin, DXR）是一种抗癌抗生素，它属于广谱、强效的蒽环类（Anthracyclines），可以组成多种化疗的联合方案，具有良好的疗效^[2]。阿霉素四个并列的六元环可以牢牢的嵌入DNA碱基之间，DNA结合的药物可以显出明显的橙黄色荧光带，阿霉素的氨基糖能与DNA双链核苷的磷酸及相隔的磷酸结合，因此使双链局部解旋，使双螺旋结构发生变化^[3]。在蒽环结构下，DNA双链丧失了活性。蒽环的B、C环与DNA相互作用，为了改变模板的功能并且抑制RNA和DNA的合成^[4]。对于增殖细胞，阿霉素是具有较强的杀伤力，它属于周期特异性的药物，但是，阿霉素对于G0期细胞的作用较弱，对于HeLa细胞而言，主要抑制G2期，这样可以阻止HeLa细胞向转变成为M期^[5]。在临床上，多柔比星对于恶性淋巴瘤（英文缩写：ML）、乳腺癌（英文缩写：BRCA）、白血病（英文缩写：AML）、肺癌等^[6,7]肿瘤疾病， 是治疗癌症强力的药物。它在肿瘤的化疗中具有决定的作用。阿霉素可广泛分布在各个组织脏器中，所以它会产生多脏器毒性^[8] ，这是经过动脉注射、静脉注射或者腹腔注射给药后得出

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