论文总字数：16946字

摘 要

白藜芦醇属于非黄酮类多酚化合物，它有二苯乙烯结构，生物性很强。白藜芦醇主要存在于植物中，比如葡萄、虎杖、桑椹等。它还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面的功能，有利于我们的身体健康，因而需求量很大。由于其功能多样且不易从自然界直接获得，故人工合成具有很大的市场价值，值得人们深入的研究。

本实验选择实验室构建的含糖基转移酶ZS1的大肠杆菌工程菌作为研究对象。对糖基转移酶ZS1进行基因获取，选择酶结构中可能的影响转糖基化活性及底物选择性的8个氨基酸位点，再根据已有的GTzs1基因序列设计QuickChange引物，通过PCR反应分别将各位点上的氨基酸突变为丙氨酸，得到了GTzs1对应的8个突变体基因，来构建含糖基转移酶突变基因的大肠杆菌工程菌，再用这些突变体去对白藜芦醇进行催化，进行酶催化的糖基化反应。

关键词：白藜芦醇 糖基转移 PCR 定点突变 酶表达 糖基化

Glycosyl transferase ZS1 and its mutant study of resveratrol regioselectivity

ABSTRACT

Resveratrol is a non-flavonoid polyphenol compounds containing stilbene structure.Resveratrol is mainly present in grapes, giant knotweed, peanuts and other plants,It has anti-cancer, anti-oxidation, regulating blood lipids, affect the life and many other important functions beneficial to human health, and therefore in great demand.Because of its versatile and easily obtained directly from nature, it is synthetic has great market value, worthy of further study.

The laboratory was chosen to build the sugar glycosyltransferase ZS1 engineering bacteria E. coli as an object of study.Of glycosyltransferase gene ZS1 acquisition, select the enzyme structure in turn may influence glycosylation activity and substrate selectivity of 8 amino acid positions,Then according to the existing GTzs1 QuikChange primer design gene sequences by PCR reaction respectively on each site of the amino acid alanine mutation,GTzs1 obtained corresponding to 8 mutant genes to build sugar transferase enzyme engineering bacteria E. coli mutant gene,Then these mutants with a catalytic resveratrol, glycosylation enzyme-catalyzed reaction

Keywords: resveratrol; glycosyltransferase; PCR; site-directed; mutant; enzyme ;expression of glycosylated

目 录

摘要 I

ABSTRACT III

第一章 文献综述 1

1.1 白藜芦醇 1

1.1.1白藜芦醇简介 1

1.1.2白藜芦醇作用 1

1.2 虎杖苷 1

1.2.1虎杖苷简介 1

1.2.2虎杖苷作用 1

1.2.3白藜芦醇糖苷的提取方法^[19] 1

1.2.4白藜芦醇苷的分析检测方法 2

1.3.糖基转移酶 2

1.3.1糖基转移酶的概述 2

1.3.3糖苷的提取 2

1.4糖基化 2

1.5定点突变 3

1.6研究本课题目标和意义 3

第二章 糖基转移酶及其突变体的构建 4

2.1 实验材料 4

2.1.1菌株及质粒 4

2.1.2试剂 4

2.1.3实验准备 5

2.1.4仪器 6

2.2试验方法 7

2.2.1. 糖基转移酶表达载体的构建及大肠杆菌的转化 7

2.3糖基转移酶zs1的表达 11

2.4利用His-tag标签纯化糖基转移酶ZS1 12

2.5 高效液相及质谱分析 12

2.6 结果与讨论 12

2.6.1. 糖基转移酶ZS1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证及表达载体的测序验证 12

2.6.2. 糖基转移酶ZS1在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达验证 12

2.6.3. 糖基转移酶ZS1的纯化 13

第三章 糖基转移酶zs1及其突变体催化白藜芦醇 14

3.1糖基转移酶的突变体 14

3.1.1试验方法 14

3.2 PCR反应 14

3.2.1 PCR简介 14

3.2.2 PCR原理 14

3.2.3 PCR发展 15

3.3 结果与讨论 15

第四章 结论和展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

1.1 白藜芦醇

1.1.1白藜芦醇简介

白藜芦醇化学名称为3,5,4′-三羟基二苯乙烯，分子式为C₁₄H₁₂O₃,分子量为228.25,是无色针状晶体,难溶于水,在紫外光210 nm处有强吸收，次强吸收峰分别出现在305~330和280~295 nm处^[1],它的结构与雌激素己烯雌酚^[2]很相像。人类第一次获取白藜芦醇是在1940年一个研究者从毛叶藜芦的根中提取出来的。^[3]

1.1.2 白藜芦醇作用

经过实验证明，白藜芦醇能对肿瘤起到一定的抑制作用，抑制肿瘤的生长^[4]，它能够使癌细胞自溶的速度加快^[6]； 除此之外，人们还证明了白藜芦醇能够通过舒张血管等方法来保护心血管，这对有心血管疾病的人是个福音^[7]，有效减少发生这类疾病的风险^[8];白藜芦醇还会减少心脏病发生的几率^[9]；它还可以起到抗氧化的作用，^[10]另外，白藜芦醇还可以防止衰老，防止氧化，对抗衰老有很好的作用^[11]； 经过大量的实验证明，它还可以抑制细菌生长，人们最初认识它的时候就是通过它可以对植物进行抑制细菌生长来了解的^[12]，白藜芦醇还可以从买麻藤中提取出来，从它提取出来的有抗菌作用^[13]；它对人的皮肤也有抗菌作用；^[14]它对绝经期的女性的有着很好的雌激素作用，能够预防些妇科疾病；^[15]它还能够食用，有着药用价值，就比如预防非典，抑制病毒的生成.^[16][17]

1.2 虎杖苷

1.2.1 虎杖苷简介

虎杖苷，分子式为C₂₀H₂₂O₈，是从虎杖根中提取的一种多酚类物质，化学名3,4,5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷。

1.2.2虎杖苷作用

白藜芦醇苷有很多药理作用，比如抑制病毒的生成，抑制肿瘤的生成，防止氧化，防止血脂升高等，这些都是需要大量研究的地方，很多媒体都在密切关注报道它的研究提取进展。^［18]

1.2.3白藜芦醇糖苷的提取方法^[19]

提取方法总共有三种，提取法：一般采用回流提取、CO2超临界流体萃取、超声提取的方法,而且步骤较多，操作有些复杂；化学合成法：步骤繁琐，反应试剂与催化剂会破坏环境，造成污染，立体选择性比不是很完美；酶法：这个方法是最简单易实施的，绿色安全，值得我们深入研究。

1.2.4白藜芦醇苷的分析检测方法

高效液相色谱法（HPLC）它的效率很高，速度快，灵敏度强,高效毛细管电泳法（HPCE）毛细管电泳它的分离样品的速度更快，而且很少消耗取样量，也很少浪费溶剂。色质联用技术，既可分离又可定性。

1.3.糖基转移酶

1.3.1糖基转移酶的概述

在糖基化过程中最关键的酶就是糖基转移酶，此类酶主要任务就是将活性供体的糖单体部分转移到特异的受体上。天然酶GTs通常是用来连接糖苷键的，由此而来的具有扩展的或者必需的底物特异性工程GTs，是来合成连接或合并非天然单糖的方式，在合成型非天然存在以及生物学相关的糖结构方面有着极大的潜力。

1.3.3 糖苷的提取

在合成糖苷化合物的过程中，利用到最多的就是糖基转移酶，而现在能够提取得到糖苷化合物的方法有三种：生物提取法，化学合成法和酶法。现在从生物体中提取糖类化合物的方法还是挺困难的，因为要提取的化合物在生物体中所占的量是很少的，很难提取出来，而且也不方便；用化学方法的话也有一些困难，需要很多保护步骤和措施，而且产率也不尽如人意；酶法合成就方便多了，没有那么多复杂的步骤，没有太多污染，反应条件也很温和，也值得人们的大力研究，但利用酶法生产糖苷类化合物仍有许多困难，比如反应时速度不够快，生产效率不太高，成本过高，分离产物时都有许多麻烦等问题。

1.4糖基化

白藜芦醇的糖基化会改变它自身的一些性质，比如理化性质，生物活泼性等，都会发生些改变，甚至改变它的水溶性。糖基化这一过程可以增加化合物的水溶性，本身就是亲水性的糖类衍生物，会结合到糖苷配基上，就能增加最终产物的亲水性，利于它在细胞和生物体内的蕴藏。通过对可能改变底物白藜芦醇区域选择性的氨基酸进行突变，获得对白藜芦醇糖基化位点发生改变的突变体，来调控酶催化的糖基化反应。而糖基转移酶则是白藜芦醇糖基化重要催化物，它可以将糖基从活化的供体分子转移到白藜芦醇的3’，4’位，生成糖苷类化合物。

1.5定点突变

寡聚核苷酸定点突变是由加拿大著名科学家Smith^【20】所发明，自此之后这一新型技术也使得蛋白质改造研究也进入了崭新的篇章，他也因为这一杰出成果得到了1993年度诺贝尔化学奖。可以随意地在已发现的DNA序列中替代、加入或切除规定长度的核苷酸片段便是定点突变的特点。

目前，我们使用较多的定点突变技术如下几种：（1）PCR介导的定点突变；（2）寡核苷酸引物介导的定点突变^[21]；（3）盒式突变。

1.6研究本课题目标和意义

本论文是研究糖基转移酶ZS1的哪些氨基酸和底物相互作用会对白藜芦醇的区域选择性造成影响的因素，通过糖基转移酶进行蛋白质的改造，并获得相关的突变体来验证这些因素是否对白藜芦醇的区域选择性发生改变。

第二章 糖基转移酶及其突变体的构建

2.1 实验材料

2.1.1菌株及质粒

地衣芽孢杆菌ZSP01（Bacillus licheniformis ZSP01）由本实验室自行筛选分离并保存。大肠杆菌Escherichia coli菌株BL21（DE3）、DH5α及质粒pET28a( )均由本实验室保存。

2.1.2 试剂

表2-1 实验试剂

2.1.3实验准备

培养基配方

请支付后下载全文，论文总字数：16946字