论文总字数：20174字

摘 要

半乳糖基转移酶是一种催化酶，它可以将活性半乳糖残基从核苷二磷酸半乳糖中转移给糖基受体分子。半乳糖基转移酶都以UDP-Gal为糖基供体，由于形成的二糖键的不同也就有α1，3-半乳糖基转移酶、β1，3-半乳糖基转移酶、β1，4-半乳糖基转移酶等数十种不同的半乳糖基转移酶。本论文中我们以β1，4-半乳糖基转移酶进行克隆与表达。

本文采用PCR技术以巨大芽孢杆菌的基因组为模板克隆出β1，4-半乳糖基转移酶基因，测定克隆获得的DNA片段，与从基因数据库中调取的基因一致。将pcr扩增获得的目的基因BMGA2构建到pet28a载体中，得到重组表达载体pet28a-GA2，再把载体转化到感受态细胞，蛋白胶验证，最后优化表达条件。

关键词：半乳糖基转移酶 克隆表达 表达条件优化

A clonal expression of galactosyltransferase

Abstract

Galactosyltransferase is the enzyme that catalyzes the transfer of the active semi lactose resi due from the caramate half lactose to the glycogen receptor molecule.Galactose base - galactose transferase with UDP as glycosyl donors, are due to the different form the disaccharide keys hav -e alpha 1, 3 - galactosyl transferase,beta 1, 3 - galactosyl transferase, beta 1, 4 - galactosyltransf -erase and so on dozens of a lot of different galactosyl transferase.In this paper, we clone and exp -ress the enzyme, beta 1, 4-galactosyltransferase.

In this passage ,we use PCR technology.Pet28a was used to clone the beta 1,4-galactogenic transferase gene.The DNA fragments obtained from cloning were identical to those obtained fro -m the genetic database.The gene BMGA2, that is the target gene for amplification of PCR, was built into the pet28a carrier, which was reprogrammed to express the expression, pet28a-ga2.And then convert it into the e. coli BL21 sensor -y cell, and verify that the recombinant is correct and then express.Finally, the express -ion condition is optimized.

Key Words: galactosyltransferase;cloning and expression; the optimization of expression condition

目录

摘 要 I

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 半乳糖基转移酶的研究进展 1

1.2.1 两类β1,4-半乳糖基转移酶 1

1.2.2 β1,4-半乳糖基转移酶的分离与克隆 2

1.2.3 β1,4-半乳糖基转移酶的化学结构 2

1.2.4 β1,4-半乳糖基转移酶的理化性质 3

1.2.5 β1,4-半乳糖基转移酶的生理学功能及应用前景 3

第二章 半乳糖基转移酶的克隆与表达 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 菌株与质粒 5

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 主要设备及仪器 7

2.1.4 培养基 8

2.1.5 电泳相关溶液 8

2.1.6 电泳凝胶配制 9

2.2 实验方法 10

2.2.1 NCBI中寻找目的基因组及引物的设计 10

2.2.2 基因组的提取 10

2.2.3 目的基因的扩增 11

2.2.4 回收目的基因片段 12

2.2.5 质粒的提取 12

2.2.6 表达载体pet28a的构建 13

2.2.7 大肠杆菌感受态的制备 14

2.2.8 重组质粒的转化 14

2.2.9 菌落PCR鉴定与测序 14

2.2.10 诱导温度、诱导剂浓度与诱导时间的优化 15

2.3 结果与讨论 15

2.3.1 β1,4-半乳糖基转移酶的克隆 15

2.3.2 表达条件的优化 17

2.3.3 讨论 18

第三章 结论与展望 19

3.1 结论 21

3.2 展望 21

参考文献 20

目录

致谢 22

第一章 文献综述

1.1 前言

特异性不同的转移酶可以完成不同半乳糖基的转移，即使是转移相同的半乳糖基，只要半乳糖基的受体不同，形成的糖苷键也就会不同，自然也就会由不同的酶催化^[1]。半乳糖基转移酶有多种，其中β1，4-半乳糖基转移酶是研究最多的一种，它的主要功能是将半乳糖基从尿苷二磷酸半乳糖上转移到N-乙酰基葡萄糖上，形成β1，4-糖苷键^[2]，尿苷二磷酸半乳糖为供体，N-乙酰葡萄糖为受体。作为受体的N-乙酰葡萄糖可以是自由单糖也可以是糖蛋白或糖脂的糖侧链的非还原性末端单糖^[3]。

本文采用PCR技术以巨大芽孢杆菌的基因组模板克隆出β1，4-半乳糖基转移酶基因，测定克隆获得的DNA片段，与从基因数据库中调取的基因一致。

1.2 半乳糖基转移酶的研究进展

1.2.1两类β1，4-半乳糖基转移酶

根据mRNA转录子的大小不同，可以将β1，4-半乳糖基转移酶分为短型和长型两类。尽管这两类被相同基因编码，但是调节方法不同。短型的位于高尔基体的成熟面，发挥糖基转移酶的功能；长型的位于细胞表面作为识别因子介导细胞与细胞间、细胞与细胞质基质间的相互作用^[4]。长型的β1，4-半乳糖基转移酶与细胞骨架相连，细胞骨架对长型β1，4-半乳糖基转移酶有重要作用。所以这13个氨基酸的延伸部分会通过加强细胞骨架与β1，4-半乳糖基转移酶之间的相互作用成为长型的β1，4-半乳糖基转移酶的定位信号。

1.2.2 β1，4-半乳糖基转移酶的分离与克隆

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