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摘 要

醇脱氢酶广泛地存在于细菌、酵母和霉菌中，在胞内代谢具有重要的生理意义，催化醇的氧化或酮、醛的还原。醇脱氢酶作为一类重要的生物催化剂，可用于选择性氧化或不对称还原反应来制备药物中间体—手性醇。醇脱氢酶已经广泛应用于不对称催化合成。

本课题以苯乙酮为底物，以全细胞生物催化手段，对来自极端环境的10株菌进行醇脱氢酶活性的筛选（菌种来自新疆农科院微生物所）。初步得到具有醇脱氢酶活性的CO20043-41菌株。该菌株能够催化苯乙酮还原产生苯乙酮，且具有较好的转化效率。还原反应的条件：选择对数生长后期细胞（菌龄12h）、温度37℃、pH为8.0。

关键词：醇脱氢酶 筛选 苯乙酮 生物转化，酶催化

Screeening of Novel Carbonyl Reductase / Alcohol Dehydrogenase

Abstract

Alcohol dehydrogenase is widely present in microorganisms such as bacteria, yeasts and molds and has important physiological significance in intracellular metabolism, catalyzing the oxidation of alcohols or the reduction of ketones and aldehydes. Alcohol dehydrogenase, can be used for preparation of pharmaceutical chiral acohol as a class of important biocatalysts selective oxidation or asymmetric reduction.

In this paper, the alcohol dehydrogenase activity of the 10 of strains that from extreme environment was screened (kindly provided by Xinjiang Academy of Agriculture Science) by using whole cell transformation, acetophenone serving as substrate. The initial results indicated that, CO20043-41 is able to prouce phenylethyl alcohol by reduction of acetophenone with high conversion. The optimal reaction condition for biotransformation was as follows:(fungus age 12h, pH8.0, 37℃).

Key words: Alcohol dehydrogenase; Screening; Acetophenone; Biotransformation; Enzymatic catalysis;

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2 ADHs不对称还原的反应机制 1

1.3醇脱氢酶的分类 2

1.3.1按来源分类 2

1.3.2按ADHS亚基分子大小分类 3

1.3.3按辅酶倾向性分类 3

1.4醇脱氢酶的结构特点 3

1.5醇脱氢酶的筛选方法 4

1.5.1一般方法：多重筛选 4

1.5.2显色法 5

1.6蛋白质工程在ADHS中的应用 5

1.6.1定点突变 5

1.6.2 定向进化 6

1.7 酶定向进化中的筛选方法 6

1.7.1体外区室化法（IVC）方法 6

1.7.2 超高通量筛选（UHTS）方法 7

1.7.3酶定向进化中的筛选方法之间的联系 8

1.8本论文研究的意义 8

1.9 本课题研究的目标与内容 9

1.9.1 研究目标 9

1.9.2 研究内容 9

第二章 实验材料与方法 10

2.1 材料与仪器 10

2.1.1 实验材料 10

2.1.2 实验试剂 10

2.1.3 实验仪器 11

2.2培养基的配制 12

2.3 菌种的培养 12

2.4 菌种保藏 12

2.5 菌种鉴定 13

2.5.1 观察平板上菌落形态 13

2.5.2 电子显微镜观察菌落形态 13

2.5.3 分子鉴定 13

2.6 底物苯丙酮溶液的制备 13

2.7 磷酸钾缓冲液配制方法 14

2.8 醇脱氢酶活性的鉴定 14

2.8.1 样品溶液的配制 14

2.8.2 苯乙酮底物标准溶液的配制 14

2.8.3 苯乙醇产物标准溶液的配制 14

2.8.4 气相检测方法 14

第三章 结果与讨论 16

3.1 菌种鉴定结果 16

3.1.1 菌落基本特征 16

3.1.2生理生化鉴定 16

3.2气相检测结果 17

3.2.1 底物苯乙酮标准品气相图谱 17

3.2.2 产物苯乙醇标准品气相色谱图 18

3.2.3 样品气相色谱图 18

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 文献综述

1.1引言

醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase, ADHs， EC.1.1.1.1)，是一类氧化还原酶^[1]。醇脱氢酶催化体系一般需要辅助因子（辅酶）进行电子转移，同时催化酸、醇或酮进行氧化还原反应。如图1-1所示，其催化NADH氧化为NAD 并伴随着手性酮的还原，将廉价的醇氧化成酮。ADHs广泛存在于绝大多数微生物、动植物的细胞内，参与许多特定代谢活动及生理生化反应，在其中发挥重要的作用，如：催化糖类、激素、脂肪酸等各种氧化还原代谢，都是生命活动不可缺少的关键^[2,3]。除了在细胞内参与各种生命活动外，醇脱氢酶还是药物和农药合成的重要手性单元。传统合成醇用的是化学法，化学法合成对环境的污染大，生产成本也高，然而醇脱氢酶作为生物催化剂，对于改进制造工艺和降低工业生产成本起着至关重要的作用，比如：底物谱广、对环境污染小、选择性高等优势，所以，改变传统的醇合成方法具有重要的意义和应用前景^[4]。

图1-1 醇脱氢酶催化反应示意图

1.2 ADHs不对称还原的反应机制

ADH_S在进行不对称还原催化反应时，NADH 被氧化，释放出的质子与酶结合，酶活性中心释放出氧化形式的NAD ，再利用其他方式将氧化型NAD 还原成NADH重新进入催化体系进行辅酶的循环利用。如下图 1-2所示，辅酶烟酰胺环上C4的质子转移给底物羰基碳的途径共有四条。当质子从si-面进攻羰基中的碳时（以图中E1或E2的方式），遵循anti-Prelog的原则 ^[5]，得到R型产物；另一种，质子从re-面进攻羰基中的碳时（以E3或E4的方式），遵循Prelog原则，得到的是S型产物，因此，从中可看出质子进攻的方向是由底物与酶结合的方向决定的。此外，酶的类型决定了辅酶烟酰胺环上C4的是产生前体-﹙R﹚-H或是前体-(S)-H的底物。Martinsde等获得了 (R)-2-羟基戊二酸脱氢酶 (HGDH) （NADH依赖型酶）的酶结晶结构，并分析了此酶在催化2-酮戊二酸生成（R）-2-羟基戊二酸过程中的氢质子转移机制，验证了辅酶烟酰胺环上C4 前体-(R)-H进攻底物si-面，生成了R型产物。

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