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摘 要

人参皂苷是人参这种传统中药材的有效活性成分，其具有多种生物学特性。酶法糖基化合成人参皂苷除了能改变其水溶性、稳定性、生物活性以及清除外源和内源毒物毒性，还能改变与受体分子的识别特性，因此这是满足科研和临床需要的新型人参皂苷合成方法。生物合成人参皂苷的最后一步是由糖基转移酶（UGTs）介导的糖基化，其对结构和功能的多样性影响很大。

应用高效表达的微生物源糖基转移酶催化珍稀人参皂苷以及优化其反应条件是本论文的目的。此文的新型糖基转移酶来源于地衣芽孢杆菌，应用分子生物学技术及基因工程构建所需工程菌，高效表达糖基转移酶，利用生物酶法催化人参皂苷来验证该糖基转移酶的功能，然后用控制变量法进行重复反应实验，测定不同DMSO浓度（5%-10%）、不同PH(6.5-9.0)、不同PPD:UDPG（1:1-1:5）以及不同温度（25 ℃-45 ℃）条件下的原人参二醇及单双糖产物占比。最终得出DMSO的浓度为10%、pH 为7.0、PPD:UDPG为1:4、反应温度为30℃时，双糖产物转化率最高即PPD的转化率最高，所以可确定这些条件即为UDP糖类的ZS1糖基化模式的最佳催化条件。

关键词：异源表达 人参皂苷 糖基转移酶 酶催化

Study on the reaction conditions of ginsenosides catalyzed by microbial glycosyltransferase

ABSTRACT

Ginsenosides are the most effective component of Panax ginseng, which have many biological characteristics. Because glycosylation can not only change its water solubility, stability, biological activity and eliminate the toxicity of exogenous and intrinsic toxicants, but also change the recognition characteristics with receptor molecμles. Therefore, it is a good synthesis method of rare ginsenosides to meet the needs of scientific and clinical research. The final step in biosynthesis of ginsenoside is the glycosylation mediated by UGTs, which has great influence on the diversity of ginsenosides structure and function.

The purpose of this research is to use the highly expressed microbial glucosyltransferase to catalyze rare ginseng saponins and optimize their reaction conditions. The novel glycosyltransferase in this paper is derived from Bacillus licheniformis, which was inserted into E. coli using molecμlar biology techniques and genetic engineering. The efficiency of the glycosyltransferase was verified by cell-free enzyme catalysis of ginsenosides, Then the repetitive reaction experiment was carried out by using the method of control variables，The proportion of propanaxadiol and monosaccharide products at different DMSO concentrations （5%-10%）, different pH (6.5-9.0), different PPD:UDPG（1:1-1:5）and different temperatures （25℃-45℃）were determined. Finally, when the concentration of DMSO is 10%, pH is 7.0, PPD:UDPG is 1:4, and the reaction temperature is 30 ℃, the conversion of disaccharide product is the highest, that is, the conversion of ppd is the highest. Therefore, these conditions can be determined as the best catalytic conditions for the ZS1 glycosylation model of udp carbohydrates.

Key word: Heterologous expression; ginsenoside; glycosyltransferase; enzymatic

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 人参皂苷的的价值及糖基化的意义 1

1.1.1 人参皂苷类产物的简介 1

1.1.2 药用价值 1

1.1.3 糖基化修饰 2

1.2 人参皂苷的制备获取方法 2

1.2.1 植物提取 2

1.2.2 化学法 2

1.2.3 酶法合成 3

1.3 生物酶法合成人参皂苷进展 3

第二章 地衣芽孢杆菌糖基转移酶的表达及催化人参皂苷反应条件的优化 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 菌株和质粒 4

2.1.2 实验试剂与仪器 4

2.1.3 培养基 5

2.2实验方法 6

第三章 结果与讨论 9

3.1 结果与讨论 9

3.1.1 糖基转移酶诱导表达及乳糖诱导剂的优化 9

3.1.3 糖基转移酶蛋白浓度测定 10

3.1.4 反应条件优化 11

第四章 结论与展望 14

4.1 结论 14

4.2展望 14

参考文献 16

致谢 18

第一章 文献综述

1.1 人参皂苷的的价值及糖基化的意义

1.1.1 人参皂苷类产物的简介

人参作为一种名贵的东方传统使用的多年生草本中药材，已经被广泛运用于国内外^[1]。人参的主要成分有如下几种：蛋白质、皂苷、挥发油及多糖等^[2]。近代药理学研究证明，人参的所有基础物质中影响内分泌系统、心脑血管系统、免疫系统以及神经系统的首要成分是人参皂苷^[3]。

1.1.2 药用价值

1.影响中枢神经系统：不同的机体机能状态常常会使得人参表现出截然不同的药理活性作用，其中人参皂苷中的Rb类可以对人或者其他动物机体的中枢神经系统起到抑制作用也就是说具有镇定的效果，而Rg类的效果恰恰相反它能于体内的某些受体结合起到兴奋作用^[4]。 人参通过对神经细胞存活机制和保护机制产生作用来影响中枢神经系统的生命活动，从而促进神经发育，使得神经可塑性得以增加，同时还能增强人体能适应环境和抵抗有害因子的能力，调节且控制激素、神经递质和酶的产生和释放，对智能和两性功能有良好改善作用。

2.影响心血管系统：人参对心血管系统的作用极其广泛。首先是对心脏的作用。简单来说，就是低促高依的效果。小剂量可以加强心脏的收缩能力，而大剂量却降低心脏的收缩能力。同样他对心肌细胞也具有保护和修复的能力，一方面人参中的有效成分可以直接参与细胞内的生理活动的调控，另一方面可以诱导细胞增加或者减少某类激素的合成对整个心肌组织。 同样人参对人体的血管以及血压也具有相似的双向作用。利用此效果可以减少多种心脏病的发病几率以及降低心脏类疾病的死亡率；刘洁等^[5]国内外的大量研究发现人参皂苷Rg2对超氧化物歧化酶(SOD)的生物活性有明显的的提升。同样的人参中的活性物质可以清除动物体内的代谢代谢废物，特别是对脂类物质代谢废物丙二醛的清除有明显的效果。因此人参对心源性休克有良好的治疗作用。

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