论文总字数：15428字

摘 要

基于比率型荧光探针在半胱氨酸检测中的明显优势，本实验以内部电荷转移（ICT）为原理，设计了一种用于检测半胱氨酸的比率型荧光探针NACys。我们选择半花菁作为荧光骨架和丙烯酸酯基团作为检测部分，与同型半胱氨酸和谷胱甘肽相比，对半胱氨酸具有高选择性和快速反应。通过内部电荷转移（ICT）过程改变了受体荧光团的吸收光谱，使之与主体荧光团的发射光谱产生重叠，产生荧光。此外，该探针具有极高的灵敏度和选择性，检测限达到0.2 μmol/L，可实现半胱氨酸的快速准确检测。

关键词： 半胱氨酸 荧光探针 ICT 半花菁

Abstract

Based on the obvious advantages of ratiometric fluorescent probes in the detection of cysteine, this experiment designed a ratiometric fluorescent probe f-or detecting cysteine based on internal charge transfer (ICT). We chose the m-erocyanine dye as the fluorescent backbone and acrylate group as the detectionmoiety, and have high selectivity and rapid response to cysteine compared withhomocysteine and glutathione. The absorption spectrum of the acceptor fluorophore is altered by an internal charge transfer (ICT) process to overlap with the emission spectrum of the host fluorophore, producing fluorescence. In addition,the probe has extremely high sensitivity and the detection limit reaches 0.082 μmol/L, which enables fast and accurate detection of cysteine.

Keywords: Cysteine; Fluorescent probe; ICT; The m-erocyanine dye

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 半胱氨酸的简介 1

1.1.1 半胱氨酸的结构 1

1.1.2 半胱氨酸的生理功能 1

1.2 半花菁的简介 2

1.3 检测半胱氨酸的方法 2

1.4 分子内电荷转移 2

1.5 荧光探针 3

1.5.1 荧光探针的基本原理 4

1.5.2 有机荧光探针的分类 4

1.5.3 荧光探针的组成 6

1.6 本课题的意义 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验仪器与试剂 7

2.1.1 实验所使用仪器 7

2.1.2 实验所使用试剂 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 荧光探针的制备 8

2.2.2 选择性试验 8

2.2.3灵敏度实验 8

2.2.4 细胞成像实验 9

2.2.5 动力学实验 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 结果 10

3.2 讨论 12

第四章 总结 20

参考文献 21

致 谢 24

文献综述

半胱氨酸介绍

半胱氨酸结构

半胱氨酸(Cys)是体内唯一含还原性巯基的天然氨基酸[1]，是谷胱甘肽、乙酰辅酶 A、牛磺酸 的前体，也是生物体铁硫簇的重要硫来源。其化学名称β-巯基-α-氨基丙酸(如图1),是不带有电荷的氨基酸,含有巯基,半胱氨酸分子之间可以通过自发的氧化反应生成二硫键,在蛋白质分子中,有助于稳定蛋白质的结构[2]。同时也是人体必需的氨基酸,还可以从人体内的甲硫氨酸转化过来[3]。

图 1 Cys、Hcy和GSH的化学结构

半胱氨酸的生理功能

半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（Gsh）是最重要的低分子量氨基硫醇[4]。还参与基因翻译后的修饰、生物催化等重要生理过程，在维持生物氧化还原稳态，蛋白质合成和翻译后控制中起着至关重要的作用。哺乳动物机体内的生物硫醇( 半胱氨酸 Cys、同型半胱氨酸 Hcy 和还原谷胱甘肽 GSH) 在建立自由硫醇和二硫化物之间的平衡以及维护生物还原状态过程中发挥着重要的作用[5]。生物硫醇浓度的不正常会导致多种疾病。半胱氨酸的缺乏将会导致皮肤疾病、儿童生长缓慢、肝脏损伤; 血浆中 Hcy浓度过高会诱发心血管疾病、阿尔兹海默病以及骨质疏松[5]。机体内 GSH 的浓度是评价机体氧化状态的关键指标，白血病、癌症以及艾滋病的发生均表现出 GSH 浓度的异常。所以，我们通过定量、专一性检测这几种氨基酸在生物体内含量的变化，可以为体内某些疾病的诊断提供正确的依据[6]。但是由于生理过程中三种氨基酸的生物化学功能各不一样，我们很难同时区分这三种氨基酸，因此，开发用于鉴别特异性检测上述 3 种生物硫醇的荧光探针有挑战性。

半花菁的简介

半花菁染料属于花菁的一种，在结构上，半花菁一部分为具有正电荷的含氮季胺盐杂环（如吡啶、喹啉、吲哚、噻唑、吡咯等），作为电子受体，另一部分为取代胺基芳环（如常见的苯胺结构），作为电子供体，二者之间通过一个共轭体系连接在一起（如常见的甲川）[7]。早在二十世纪九十年代，Fromherz P.等人就将半花菁荧光染料应用于水蛭神经元细胞方面的研究[8]。目前，基于半花菁染料的荧光探针广泛应用于荧光温度计、光学增感剂、复杂生物体系的分子标记、活细胞染色剂、非线性光学材料等领域[9]。

具有优越的光学性能和高极化率，摩尔吸光系数大，吸收和发射波长相对较长，荧光量子产率较高，斯托克斯位移大等优点，通过共轭链长度的调节，花菁的光谱可以从可见光区一直延伸到近红外区，采用红区测量可有效地排除背景干扰，获得更为理想的分析灵敏度和选择性[10]。花菁染料已被证明能够检测金属离子、阴离子、活性小分子和生物大分子等，其光谱对外界微环境的变化极为敏感，能够评估与环境相关的参数，包括温度、极性、粘度等，非常适合生物及环境样品的分析研究[11]。但是，传统的半花菁类染料结构上没有可以修饰的参与共轭的基团，只能通过与其他染料杂化的方式构建具有新功能的半花菁模板。因此，有必要开发新的识别机理来构建基于半花菁染料的荧光探针。

检测半胱氨酸的方法

目前国内外检测Cys、Hcy和GSH的方法有很多，主要有以下几种；

①高效液相色谱法（HPLC）：其具有操作简单、高效便捷、灵敏度高、选择性好的优点,但分析成本高,容易损失。

请支付后下载全文，论文总字数：15428字