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摘 要

骨肉瘤，多发于青少年，患者选择截肢或手术联合术后化疗，生存率均不能明显改善。故本实验尝试使用冬凌草甲素，研究其诱导人骨肉瘤细胞凋亡的作用。本实验选用人体正常细胞和人体正常的成骨细胞进行MTT试验，发现冬凌草甲素并不会对人体正常细胞活力产生显著的抑制作用；再选用人骨肉瘤细胞，通过MTT试验评价冬凌草甲素对人骨肉瘤细胞活力的抑制作用；之后进行DAPI染色试验来研究冬凌草甲素是否会诱导人骨肉瘤细胞凋亡；通过Annexin V/PI染色试验进一步验证冬凌草甲素对人骨肉瘤细胞的促凋亡作用；最后通过JC-1实验阐明冬凌草甲素诱导细胞凋亡的分子机制。结果显示，冬凌草甲素确实可以诱导人骨肉瘤细胞凋亡且对人体正常细胞没有显著抑制。

关键词:冬凌草甲素 人骨肉瘤 细胞凋亡

Oridonin induced apoptosis in human osteosarcoma cells

Abstract

Osteosarcoma, an adolescent killer, remains the survival of patients essentially unchanged while patients choose surgical excision or chemotherapy again after resection. Therefore, this experiment attempts to induce apoptosis in human osteosarcoma cells with oridonin. MTT assay was performed using human normal cells, and it was found that oridonin did not inhibit cell viability on human normal cells. Human osteosarcoma cells were used, and the inhibitory effect of oridonin on the cell viability of human osteosarcoma cells was evaluated by MTT assay. DAPI staining test was then performed to explore whether oridonin induces cell apoptosis in human osteosarcoma cells or not; Morever, we confirmed oridonin has pro-apoptosis effect on human osteosarcoma cells by Annexin V/PI staining assay. Finally, in order to illustrate the mechanism of oridonin-induced apoptosis, JC-1 experiment was detected. Fortunately, we found that oridonin induced apoptosis in human osteosarcoma cells and did not inhibit human normal cells significantly .

Keywords: Oridonin;Osteosarcoma;Apoptosis

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 冬凌草甲素 1

1.2 骨肉瘤 2

1.3 细胞凋亡现象 3

第二章 材料和方法 6

2.1材料 6

2.1.1 试剂 6

2.1.2 仪器 6

2.2方法 7

2.2.1 体外细胞培养 7

2.2.2 MTT试验 7

2.2.3 DAPI染色试验 7

2.2.4 Annexin V/PI 染色试验 8

2.2.5 线粒体膜电位检测（JC-1法） 8

第三章结果与讨论 10

3.1 MTT法结果 10

3.1.1 冬凌草甲素对L02，HUVEC，HEK-293和hFOB1.19细胞活力的影响 10

3.1.2 冬凌草甲素对MG-63细胞活力的影响 10

3.2 DAPI染色试验 12

3.3 AnnexinV/PI染色试验 12

3.4 线粒体膜电位检测（JC-1法） 13

第四章结论 15

参考文献 16

致谢 17

第一章 文献综述

1.1 冬凌草甲素

冬凌草甲素属7,20-环氧型对映-贝壳杉烷类二萜化合物，为淡黄色针状结晶，味道极苦，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸乙酯、二甲基砜等有机溶剂[1]。如图1-1所示，其结构式为C₂₀H₂₈O₆。冬凌草甲素的抗癌活性是由于分子中α-亚甲基环戊酮部分结构，裂环或亚甲基饱和则作用消失[2]。

图1-1 冬凌草甲素的结构示意图

冬凌草甲素对多种肿瘤细胞有明显的抑制或杀伤作用，有较强的抗菌消炎作用，毒副作用较小[1]。但由于其水溶性差，口服难以达到有效的血药浓度，降低了临床疗效，限制了其临床应用[1]。常用的修饰位点有C(1)-OH和C(14)-OH。最简单的C(1)-OH和C(14)-OH修饰是利用这两个位点羟基活性的差异，通过氧化或与酰氯、酸酐等一步反应进行修饰。冬凌草甲素的C(1)、C(2)位[或C(1)、C(2)、C(3)位]修饰不同于单纯的C(1)位的简单氧化或酰化修饰，修饰的策略主要是在C(1)、C(2)位[或C(1)、C(2)、C(3)位]引入杂环结构或官能团，通过这样的修饰可以提高药物的活性及改善冬凌草甲素的水溶性[2]。

可以用乙醚提取冬凌草甲素，虽然此方法收率较高，但是由于乙醚法需要使用大量的乙醚、苯、甲醇等有毒且易燃的实验用品，容易引起不必要的危害，所以这种方法不适合产业化生产。工业化生产主要采用乙醇法，虽然收率较低，但乙醇毒性低，所需成本相对较少。工业上使用不锈钢中压柱色谱的方法，大大提高了冬凌草素的生产效率，从而实现了冬凌草甲素的连续化生产，但收率依旧不及乙醚法[3]。目前，有人采用溶剂套用的方式提取冬凌草甲素，得到目标产物浓度较高的提取液，在整个提取液处理过程中，几乎没有冬凌草甲素的损失，解决了常规的脱溶浓缩过程中冬凌草甲素大量损失的问题，收率显著升高[4]。

冬凌草甲素抗肿瘤作用机制很多，如遏制细胞周期、降低端粒酶的活性、抑制DNA、RNA、蛋白质合成、诱导肿瘤细胞凋亡等[5]。冬凌草甲素对胶质瘤SHG44细胞具有显著的抑制生长的作用，这种作用与其诱导胶质瘤SHG44细胞凋亡的效应有关[6]；冬凌草甲素对急性肝衰竭小鼠的保护作用至少部分与抑制TNF-α表达及JNK介导线粒体凋亡通路有关 [7]；冬凌草甲素能升高阿霉素处理后H9C2细胞上清液中SOD的浓度，降低MDA浓度，并促进H9C2增殖、抑制细胞凋亡[8]；冬凌草甲素能够有效增强顺铂对宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用，推测其机制是通过上调抑癌基因FOXL2表达，下调Ki67表达，从而实现抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用[9]；冬凌草甲素抑制了SW1900细胞RNA合成与细胞分裂所需蛋白质的作用，进而实现细胞的抑制与诱导凋亡[10]；冬凌草甲素可以抑制结肠癌细胞SW620增殖，促进其凋亡，上调BMP7与p53的表达以加强抑制增殖、诱导凋亡、上调BMP7表达的作用[11]；冬凌甲草素通过抑制骨肉瘤的TGF-β1/Smad2/3信号通路来阻止TGF-β1诱导的上皮-间质转化[12]；冬凌草甲素通过BMP7激活p38MAPK信号通路，进而调控HCT116细胞的增殖凋亡，发挥抑癌作用[13]；NF-κB信号激活和Integrin-β1表达在骨肉瘤生长和转移中起着至关重要的作用。Integrin-β1和NF-κB信号传导有效抑制诱导骨肉瘤细胞的凋亡，二者是抑制骨肉瘤生长和转移的有效靶点。此外，我们可以使用Integrin-β1来评估肿瘤预后情况，它是评估骨肉瘤预后状况和治疗方法的重要生物标志物之一。值得注意的是，Integrin-β1抑制剂可使常规放射疗法和化学疗法对人骨肉瘤细胞的抑制效果更好。更重要的是，在正常成骨细胞中可以观察到Integrin-β1的低表达，从而可以避免针对Integrin-β1的治疗方法会造成某些不良反应和副作用。但仍需要进一步的研究Integrin-β1诱导的骨肉瘤转移的分子机制[14]。

1.2 骨肉瘤

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