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摘 要

Alloferon (H-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-OH)最初是从实验感染的苍蝇丽蝇中分离出来的。为了增加其稳定性和表达量，本实验采用公司已构建好的以Pet-42a质粒为载体的14*Alloferon1串联基因，大肠杆菌BL21感受态细胞作为宿主细胞，在合适的条件下用不同浓度的IPTG干扰不同的时间来表达目的蛋白。并且设置了IPTG浓度梯度为0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L的诱导环境，分别在诱导0h、5h、9h、11h、14h、16h时测菌的浓度，最终得出诱导剂为1.0mmol/L、培养时间为9h时目的蛋白产出量最多。经SDS-PAGE验证表达出的蛋白大小约26kDa，和目的蛋白大小一致。进一步进行镍柱纯化出14*Alloferon，最后用胰蛋白酶酶切将14*Alloferon切成单体Alloferon，利用葡聚糖凝胶电泳分离出单体Alloferon1，为进一步的生物活性测定奠定基础。

关键词：Alloferon 转化 诱导表达 分离纯化

Cloning,expression and purification of Alloferon

Abstract

Alloferon (h-his-gly-val-ser-gly-his-gly-gln-his-gly-val-his-gly-oh) was originally isolated from flies infected by the experiment. In order to increase its stability and expression, the 14 * allofen1 tandem gene with pet-42a plasmid as the vector, and the E. The concentration gradient of IPTG was set to 0.6mmol/l, 0.8mmol/l, 1.0mmol/l, 1.2mmol/l and 1.4mmol/l. The concentration of bacteria was measured at 0h, 5h, 9h, 11h, 14h and 16h respectively. Finally, when the inducer was 1.0mmol/l and the culture time was 9h, the production of target protein was the most. SDS-PAGE showed that the expressed protein was about 26kDa, which was consistent with the target protein. Further nickel column was used to purify 14*Alloferon. Finally, the 14*Alloferon was cut into monomer Alloferon by trypsin digestion. The monomer Alloferon1 was isolated by Sephadex gel electrophoresis, which lay a foundation for further bioactivity determination.

Key words: Alloferon; conversion;Induced expression;separation and purification

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 Alloferon概述 1

1.1.1 Alloferon来源 1

1.1.2 Alloferon作用 3

1.2 IPTG诱导表达 8

1.2.1 何为IPTG 8

1.2.2 IPTG诱导原理 8

1.2.3 IPTG使用方法 9

1.2.4 IPTG诱导大肠杆菌表达 9

第二章 Alloferon的克隆表达和分离纯化 10

2.1 前言 10

2.2 实验仪器及材料 11

2.2.1 实验仪器 11

2.2.2 实验材料 11

2.3 实验过程 12

2.3.1 技术路线 12

2.3.2 实验方法与数据 12

2.3.2.3琼脂糖凝胶电泳 13

2.3.6 转化Bl21感受态细胞 14

第三章 总结与展望 20

参考文献 25

论文致谢 30

文献综述

Alloferon概述

1.1.1 Alloferon来源

[^[1]]Alloferon，这是一种新的昆虫十三肽(H-His1-Gly-Val-Ser-Gly-His6-Gly-Gln-His9-Gly-Val-His12-Gly-OH)，于2002年由Chernysh[^[2]]从感染的非洲丽蝇属(blow fly Calliphora vicina)的幼虫血淋巴中分离出来。

图1-1丽蝇感染图

这个短肽在1、6、9、12位有4个His残基，在2、5、7、10、13位有5个甘氨酸残基。[^[3]]它的主要结构类似于一些功能相关的蛋白质，如流感病毒B血凝素、牛朊蛋白I和II，以及番茄红素抗真菌蛋白。[^[4]]它与其他已知的免疫调节肽不具有氨基酸序列的任何相似性。另一方面，该肽与干扰素具有某些功能上的相似性，所以命名为Alloferon。体外实验表明Alloferon对[^[5]]自然杀伤淋巴细胞有刺激作用。进一步的研究表明，Alloferon通过NF-kB激活来刺激IFN的合成。在小鼠体内的其他实验表明，Alloferon同时具有抗病毒和抗肿瘤的能力。由于其独特的免疫调节机制，Alloferon可与其他抗病毒和抗癌药物联合使用，产生协同抗疾病作用。[^[6]]从丽蝇( Calliphora vicina) 中分离提取到的 2 个小肽Alloferon -1 和 Alloferon -2，分别13、12个氨基酸组成，其氨基酸序列分别是 HGVSGHGQHGVHG、GVSGHGQHGVHG，前者 N 端较后者多 1 个组氨酸，其余序列相同。现有的研究资料显示，Alloferon-1和Alloferon-2在体外对[^[7]]NK淋巴细胞具有刺激活性，在小鼠体内具有诱导干扰素产生、抗病毒和抗肿瘤功能[^[8]]。据现有的研究报告显示：人们更加关注具有13个氨基酸的Alloferon 1[^[9]]，Alloferon 1分子式:C52H76N22O16 分子量:1265.3，其结构式如图1-1。

图1-2 Alloferon分子结构式

1.1.2 Alloferon作用

1.1.2.1 Alloferon的抗哮喘作用

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