论文总字数：17324字

摘 要

目的：本分析实验的目的是用于验证定量检测犬血浆中右硫辛酸、左硫辛酸浓度的HPLC-MS/MS方法。色谱条件：流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈=A-B，等度洗脱：A:B=48:52，流速：0.9mL/min；色谱柱：CHIRALPAK IE（4.6*250mm，5m）柱温：25℃，进样器温度：4℃，进样量：5μL。

本实验建立了犬血浆中左、右硫辛酸的HPLC-MS/MS测定法，并进行犬血浆方法学完全验证。犬血浆样品中左、右硫辛酸的线性范围均为5～5000ng/mL，最低定量限为5ng/mL。选择性、精密度、准确度、基质效应、稀释可靠性、残留、稳定性结果均符合检测方法要求，血浆中左、右硫辛酸在-20℃冷冻条件下稳定性良好。本方法能较好测定犬血浆中左、右硫辛酸含量，专属性强，灵敏度高，稳定性好，结果准确；方法符合药代动力学研究对左、右硫辛酸生物样品的检测要求。

关键词：高效液相色谱质谱法；右旋硫辛酸；毒性比较试验；血浆中的检测

Abstract

Objective:The purpose of this analytical experiment is to verify the HPLC-MS/MS method for quantitative detection of the concentration of dextrolipoic acid and levothoic acid in dog plasma. Chromatographic conditions: mobile phase: 0.1% aqueous formic acid-acetonitrile = A-B,isocratic elution:A:B=48:52,flow rate:0.9mL/min;chromatography column: CHIRALPAKIE (4.6*250mm,5mm)25℃,injector-temperature:4℃,injection-volume:5μL.

In this experiment,HPLC-MS/MS determination of left and right lipoic acid in canine plasma was established, and canine plasma methodology was fully verified.The linear range of left and right lipoic acid in canine plasma samples is 5～5000ng/mL,and the minimum limit of quantification is 5ng/mL.The results of selectivity, precision, accuracy, matrix effect, dilution reliability, residue, and stability all meet the requirements of the detection method.The left and right lipoic acid in plasma are stable under freezing conditions at -20 ℃.This method can better determine the content of left and right lipoic acid in dog plasma, with strong specificity, high sensitivity, good stability, and accurate results; the method meets the requirements of pharmacokinetic research for the detection of left and right lipoic acid biological samples.

Keywords:high performance liquid chromatography mass spectrometry;dextrolipoic acid;comparative toxicity test;detection in plasma.

目录

2020年06月 I

摘要 II

Abstract III

第一章绪论 2

1.1硫辛酸的主要成分和结构 2

1.2研究右旋硫辛酸的毒代动力学意义 2

1.3右旋硫辛酸赖氨盐的制备 3

1.4硫辛酸的临床应用 3

1.4.1.治疗糖尿病及其并发症 3

1.4.2.强化肝功能 4

1.4.3改善老年人认知障碍 4

1.5液质联用技术^[15] 4

1.6研究依据与目的 5

第二章犬血浆中右旋硫辛酸检测 6

2.1实验仪器与使用的试剂 6

2.1.1实验仪器 6

2.1.2使用的试剂 6

2.1.3标准品 7

2.2实验方法 7

2.2.1试剂配制 7

2.2.2色谱的条件和质谱的条件 11

2.3方法学验证内容 12

2.3.1硫辛酸标准曲线的制作、线性范围的划定和最低定量限的确定 12

2.3.2精密度和准确度 12

2.3.3选择性 13

2.3.4基质效应试验 14

2.3.5稳定性考察 15

2.3.6血浆样品稀释对测定结果的影响 16

2.3.7残留考察 16

2.4方法学小结 16

2.5毒代动力学研究 16

2.6数据分析 17

2.7右旋硫辛酸血药浓度-时间数据 17

2.8结果 21

2.9讨论 21

2.10小结 21

第三章结论与展望 23

3.1结论 23

3.2展望 23

参考文献 24

致谢 26

第一章绪论

1.1硫辛酸的主要成分和结构

硫辛酸（alpha lipoic acid）是线粒体中的辅酶，类似于维生素，它除去自由基，消除由自由基导致的加速老化和致病性。通过肠内吸收将磺酸引入细胞，具有脂质溶解度和脂质溶解度特性，水溶性。 硫辛酸是B族维生素的化合物，酵母和某些微生物的生长因子。作为多酶体系中的辅酶，催化将脱羧丙酮酸氧化为乙酸，并通过酰基转移将α-酮谷氨酸氧化为琥珀酸 ^[1,2]。在动植物中得到了扩展，有R和S两种异构体，RLA和它的还原产物可作为更强的活性氧抗体。作为一种自由基消除剂，它与其他氧抗体相互作用，产生大量的内生抗氧剂，包括维生素C、Q10和维生素E。右旋硫辛酸作为一种辅助因子，通过修复作用影响许多疾病，因此右旋硫辛酸具有潜在的应用价值。 ^[3]。

图为右旋硫辛酸

图1-1右旋硫辛酸化学结构式

1.2研究右旋硫辛酸的毒代动力学意义

硫辛酸注射液是一种常于糖尿病微血管病变的药物,其抗氧化性包括清除体内自由基、金属螯合作用以及再生内源性抗氧化剂。该药物可以在保护相应靶器官的同时对抗许多种诱发糖尿病微血管并发症的因素^[4]。目前合成的硫辛酸基本上是混合物，但体内新陈代谢过程显示只有右旋硫辛酸有实际的治疗作用，左旋硫辛酸在人的身体中没有生理活性，但现在有实验证明SLA可以抵抗RLA的作用或成为它的具有竞争力的抑制剂^[5]。外消旋体硫辛酸是当前临床使用的主要药物，故而通过检测犬体内右旋硫辛酸的代谢情况，蓄积作用和是否转化为左旋硫辛酸，可以为右旋硫辛酸得到体内安全性评价可以提供依据。

1.3右旋硫辛酸赖氨盐的制备

将RLA制备成盐可提高其在水中的溶解度及其稳定性。现已研发的包括：碱金属盐，氨基酸盐，土碱金属盐，天然有机胺/酰胺盐等，以下主要介绍其赖氨酸盐的制备。

赖氨酸和RLA按比例溶解在有机溶剂和/或水中，在降低的压力浓度之后通过回馈加热并冷却来制作RLA赖氨酸盐的结晶。右旋硫辛酸赖氨盐的氨基酸特性使得所生产的盐易于溶解于水中，并且具有高熔点，从而大大提高了稳定性。在温度为105°C的恒温干燥容器中加热24小时后，物理化学特性没有变化，从而解决了RLA的易于聚合，RLA热分解的问题，并可用于制造固体和液体制剂。赖氨酸也是药物中的抗氧化剂，当赖氨酸与RLA形成复合盐后可以防止其氧化^[6]。此外，赖氨酸本身就是一种生物活性成分，使得右旋硫辛酸赖氨盐通常具有比RLA更强大的药物影响。。

1.4硫辛酸的临床应用

1.4.1.治疗糖尿病及其并发症

糖尿病是由缺乏胰岛素或胰岛素抗性引起的复杂代谢疾病，伴随着多种并发症，如白内障、神经病变、肾病等。^[7]。糖尿病引起的两种慢性高血糖，对各种组织，特别是眼睛、肾脏、心脏、血管会造成慢性损害。目前正在对神经与神经功能失调发病机制进行研究，研究表明这些机制可能与蛋白质糖基化和高糖自由基的长期氧化有关。在动物实验RLA的递送可以改变病理参数，例如糖基化血红蛋白和蛋白质氧化。这大大降低了I型糖尿病的发病率，并大大减少了动物死亡数。试验中由于RLA保护胰腺细胞B免受巨噬细胞和其他免疫细胞释放的活性氧激发，从而免疫损伤。研究肌肉细胞和脂肪细胞的培养表明，RLA通过增加某些酶的活性，改善了葡萄糖的体内代谢作用（“受体激酶”），缓解高血糖症状，从而达到治疗糖尿病的目的^[8]。

请支付后下载全文，论文总字数：17324字