文 献 综 述

题目：β-呋喃果糖苷酶的交联固定化

低聚果糖(fructooligosaccharides)是一种新型的保健食品, 是功能性低聚糖中颇具代表性的一种。低聚果糖是通过β-(2, 1)糖苷键在蔗糖的果糖基上连接1～3个果糖基而形成的一系列果糖寡聚体, 主要包括蔗果三糖(GF#8322;)、蔗果四糖(GF#8323;)、蔗果五糖(GF#8324;) [1]。低聚果糖主要通过促进双歧杆菌的增殖而调节人体肠道内的微生态平衡, 从而起到保健作用[2]。低聚乳果糖(Laetosucrose)是一种功能性甜昧剂，它几乎不为生物体消化吸收，是低热量糖质。它是以蔗糖和乳糖为原料．利用节杆菌产β一呋喃果糖苷酶合成的。节杆菌(Arthrobacter sp.)是从土壤中分离出来的一种革兰氏阳性菌，可以产生一种胞外酶一β-呋喃果糖苷酶，这种酶具有广泛的受体特性，能高效地合成非还原性的半乳糖基蔗糖一低聚乳果糖。低聚乳果糖同时又是一种双歧杆菌增值因子，其增值效果比其他功能性低聚糖如低聚果糖、低聚半乳糖等要好，可作为一 种功能保健食品，有益于身体健康，在日本已早有产品上市。[3]

国内外研究现状：由于其具有优越的生理功能特性和良好的理化特性，深受消费者和食品、制药、日化、饲料等行业的青睐，市场需求不断上升。1992年 Ensuiko公司年产500吨，1994年产量增加3倍 ，超过1600吨[4]。1995～2000年日本低聚乳果糖年产量稳定在2000吨，销售额位于低聚糖的第四，高于我国市场常见的低聚果糖和低聚异麦芽糖，具有较好的经济效益[5]。在2004年的一项调查[6]结果显示低聚乳果糖产能到达 3000吨，近年来，乳果糖的产量不断增加。每年增长速度为12.5％，日本和美国生产和消费约占70％，我国正处于快速发展阶段。低聚乳果糖在我国潜在巨大市场。因此，抓住机遇，不失时机地开发生产国内外市场需求量巨大的低聚乳果糖产品，市场前景广阔。低聚乳果糖的产业化在国内一直未见报道，目前正处于研发阶段，未能实现工业化制备，原因是在生产中酶的活力和糖的纯化制约了其在国内的发展。随着人们保健意识的日益增强和食品工业的发展，各种新型功能性食品添加剂的市场需求越来越大，作为具有巨大发展潜力的低聚乳果糖的需求缺口也将越来越大。由于我国低聚糖的种类和产能都与国外存在较大的差距，所以研究开发新型的低聚糖及实现其工业化具有重要的意义。[7]

低聚乳果糖酶法制备的合成方法：低聚乳果糖 (Lactosucrose;LS)是由葡萄糖、半乳糖和果糖组成的一种三糖，工业化生产是以蔗糖和乳糖为原料，在节杆菌β-呋喃果糖苷酶的催化作用下生成的[8,9] 。运用固定化酶不仅使得合成效率得到提高，同时实现了酶的重复利用性[10]。酶法生产有两种合成方法，一是利用半乳糖苷转移酶将乳糖分解产生的β-半乳糖基转移至蔗糖中葡萄糖的C4羟基上，如S.poroboromyces菌和Rahnella菌产生的某些酶类，二是利用果糖基转移酶将蔗糖分解产生的果糖基转移至乳糖还原性末端的C1羟基上，适合的酶类有纳豆芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶和节杆菌的β-呋喃果糖苷酶。工业上主要是利用节杆菌产的β-呋喃果糖苷酶生产低聚乳果糖。[11,12]

固定化酶的制备：1.海藻酸钠固定：称量一定质量的海藻酸钠在37℃水浴中使其溶化，再按(I:I)JH入等体积的酶混合液，静置30 min，吸入注射器内再逐滴滴入一定浓度的CaC1溶液中，室温条件下固定0.5 h-4 h，过滤、洗涤，加入戊二醛交联，再洗涤，即制备出固定化酶(ITGL)。2.壳聚糖固定：取适量的壳聚糖溶于浓度为4％醋酸溶液中，配成浓度3％壳聚糖溶液，用6号注射器将该液体从15 cm高度向下注入由20％NaOH 30％甲醛 50％去离子水组成的溶液中，得粒度均匀形状规则的壳聚糖微球，水洗至中性后，加到一定浓度的戊二醛溶液中，交联，待硬化完全后，多次水洗即得壳聚糖微球载体，加入粗酶液中静置，洗出为固定的游离酶。

固定化酶的制备结论：试验以壳聚糖、海藻酸钠为载体，采用包埋-交联法固定化β-呋喃果糖苷酶。通过试验发现，固定化酶的活力受到戊二醛浓度、加酶量、包埋时间、交联时间、联酶时间等因素的影响。试验结果表明:①以海藻酸钠为载体成球形状均匀圆滑，壳聚糖成白色球形，联酶后为黄色小球，并且小球强度良好。②正交试验设计结果比较，壳聚糖固定化酶活回收率高于海藻酸钠。采用包埋-交联固定化方法，操作简单酶活回收率高。[13]

探索适宜的树脂作为载体固定β-呋喃果糖苷酶，并研究该固定化酶催化合成低聚乳果糖。选择9种大孔吸附树脂和碱性离子交换树脂固定β-呋喃果糖苷酶，筛选固定化效果较好的树脂作为载体。用聚乙烯亚胺(PEI)修饰得到PEI-树脂，采用吸附法将酶固定于PEI-树脂上，并对固定化条件进行优化。考察固定化酶的重复使用稳定性及其催化合成低聚乳果糖的能力。通过筛选发现大孔阴离子交换树脂D311固定化效果较好，经过PEI修饰后，D311固定化效果显著提高。用PEI修饰的载体PEI-D311固定果糖苷酶，最优固定化条件为：PEI浓度2%，加酶量103 U/g，吸附温度25 ℃，吸附pH 6.0#8722;8.0，吸附时间8 h。最优条件下固定化酶活达57 U/g，酶活回收率达55.3%。用固定化酶催化水解1 mol/L蔗糖，重复利用15批载体酶活没有明显降低。用固定化酶催化合成低聚乳果糖，8 h内低聚乳果糖产量最高达到137 g/L。PEI-D311固定的果糖苷酶具有较好的重复使用稳定性及较高的低聚乳果糖合成能力，这为固定化酶法生产低聚乳果糖研究奠定了基础。[14]

由于在合成低聚乳果糖的过程中，会存在副反应和逆反应，即β-呋喃果糖苷酶会水解蔗糖产生葡萄糖和水解低聚乳果糖，会抑制合成反应的进行，如果想使反应产生更多的低聚乳果糖，就必须使用一定的手段移除反应过程中产生的葡萄糖，否则很难将低聚乳果糖的含量提高。如利用酵母消耗反应过程中的葡萄糖，利用流化床移除葡萄糖，或者利用双酶法等方法提高酶催化反应产生的低聚乳果糖含量，再通过过膜、离子交换层析等方法来提高低聚乳果糖的含量[15-18]，而国内这些技术在低聚乳果糖开发利用上的研究较少，是进一步研究的重点。