论文总字数：20773字

摘 要

敌草隆是一种内吸传导型取代脲类除草剂，施用于植物萌芽之前，被植物根部吸收后向上传导到绿色部分，通过抑制光合作用中的希尔反应，并阻断光合微生物和植物光系统Ⅱ水平的电子转移，使植物不能制造养分，造成植物饥饿而死，达到除草的目的。因此，敌草隆的剂量关系着植物的生理活性。

水稻作为全球主要农作物之一，其安全性和产量关乎着一个国家的命脉和经济可持续发展。植物激素对提高作物抗逆性的研究成为热点。因此，本课题是以水稻幼苗为研究对象，通过前处理和液相色谱—质谱联用的方法来探究水稻幼苗在不同浓度的敌草隆作用下，其内源性抗逆激素所受到的影响，以此来反映敌草隆对水稻幼苗的胁迫作用及对生理活性的影响，明确敌草隆对水稻幼苗毒作用的剂量，进一步提高水稻产量，减少水稻内的农药残留。

实验结果表明，茉莉酸与脱落酸的含量的变化趋势相似，当植物在受到高浓度的敌草隆胁迫时，茉莉酸与脱落酸的含量急剧上升以增强植物的抵抗力。这与水杨酸完全不同。在植物受到敌草隆的影响时，水杨酸含量先降低后上升。同时，通过RNA-Seq分析调控上述三种植物激素通路过程中基因的表达情况发现，多个基因发生差异表达，其中，LOC_Os08g39850、LOC_Os03g52860、LOC_Os08g39840、LOC_Os03g49350、LOC_Os02g12680、LOC_Os06g11290基因在茉莉酸合成通路中高表达；LOC_Os07g05940基因在脱落酸合成通路中高表达；LOC_Os2g41630基因在水杨酸合成通路中高表达。总结而言，本课题以每种内源性植物激素作为单独研究对象，探究了在敌草隆作用下，每种激素的含量变化趋势，为后续的研究提供了基础。

关键词：敌草隆 水稻 毒作用 植物激素 转录组

STUDY ON THE EFFECT OF DIURON ON ENDOGENOUS STRESS-RESISTANT HORMONES IN RICE TISSUES

Abstract

Diuron is an internally absorbed and conductive substituted urea herbicide, which is applied to plants before germination, absorbed by plant roots and transmitted upward to the green part by inhibiting Hill reaction in photosynthesis.It also blocks the electron transfer at the level of photosynthetic microorganisms and plant photosystem II, so that plants can not produce nutrients, cause plants to starve to death, and achieve the purpose of weeding.Therefore, the dose of diuron is related to the physiological activity of plants.

As one of the main crops in the world, the safety and yield of rice are related to the lifeline and economic sustainable development of a country.The research on the effect of plant hormones on improving the stress resistance of crops has become a hot spot.Therefore, the purpose of this study was to explore the effects of endogenous stress hormones on rice seedlings under the action of different concentrations of diuron by pretreatment and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). In order to reflect the stress effect and physiological activity of diuron on rice seedlings, clarify the toxic dose of diuron on rice seedlings, further increase the yield of rice and reduce the pesticide residues in rice.

The results showed that the change trend of jasmonic acid and abscisic acid content was similar. When plants were subjected to high concentration of diuron stress, the content of jasmonic acid and abscisic acid increased sharply to enhance the resistance of plants.This is completely different from salicylic acid.When the plant was affected by diuron, the content of salicylic acid decreased at first and then increased.At the same time, through RNA-Seq analysis, it was found that multiple genes were differentially expressed in the process of regulating the above three plant hormone pathways.Among them, LOC_Os08g39850, LOC_Os03g52860, LOC_Os08g39840, LOC_Os03g49350, LOC_Os02g12680, LOC_Os06g11290 genes were highly expressed in jasmonic acid synthesis pathway, LOC_Os07g05940 gene was overexpressed in abscisic acid synthesis pathway, and LOC_Os2g41630 gene was overexpressed in salicylic acid synthesis pathway.In summary, this paper takes each kind of endogenous plant hormone as a separate research object, and explores the changing trend of the content of each hormone under the action of diuron, which provides a basis for follow-up research.

Keywords：Diuron; Rice seedlings; Poison effect; Plant hormone; Transcript group

目 录

摘 要 I

Abstract I

目 录 1

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2水稻简介 1

1.3 敌草隆简介 2

1.3.1敌草隆作用机理及使用现状 2

1.4植物激素的结构与功能 3

1.5内源植物激素的检测方法介绍 3

1.5.1生物鉴定法 4

1.5.2毛细管电泳法 4

1.5.3气相色谱法(GC) 4

第二章 实验材料及方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 供试材料 6

2.1.2 实验材料 6

2.2 实验仪器 7

2.3实验方法 7

2.3.1 水稻种子的萌发及幼苗的培养和处理 7

2.3.2 敌草隆的配制 8

2.3.3 水稻培养液配制及水稻幼苗加药培养 9

2.3.4 培养液及水稻组织待测样品制备 9

2.3.5 混标植物激素母液的配置 11

第三章 实验结果与讨论 12

3.1 敌草隆对水稻幼苗的影响 12

3.1.1 水稻幼苗地上部分的生长情况 12

3.1.2标准曲线的绘制和检出限的计算 13

3.1.3 不同敌草隆对水稻幼苗内源性抗逆激素的影响 14

3.1.4 对水杨酸、茉莉酸、脱落酸生物合成途径中相关酶基因表达量的分析 16

3.2 讨论与分析 20

第四章 分析与展望 22

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 前言

自古以来，人们的饮食中便离不开水稻。在这几年中，发生在全球的自然灾害次数激增，产生了较大影响。此外，随着人口数量的增加，社会经济格局的改变。水资源短缺，土壤盐碱荒漠化的趋势和农业劳动力短缺等日益加剧，由此带来的各种胁迫直接影响到水稻的生产^[1]。如果在水稻生长过程中遭受到非生物和生物逆境的胁迫,就会影响其产量，甚至绝产。在与逆境胁迫的长期互作过程中,水稻自身形成了一套适应机制^[2]。现如今，为获取产量更多，品质更优的水稻，在种植水稻时往往会施用除草剂，以此消除杂草，保证水稻的营养所需。

但是，农药却是一把双刃剑。农药的不恰当使用，其带来的危害不容小觑。土壤在农药的长久污染之下，养分减少，结构改变，从而出现严重的土壤酸化现象，不利于环境的可持续性。同时，农药的各组分在分解、迁移和转化的过程中通过食物链的方式进入动物体内，乃至人体内，对人体健康产生威胁。因此，出于对食品安全以及对环境的可持续性角度来看，研究农药对农作物的生理胁迫和农作物生理变化有着深远的意义。

1.2水稻简介

水稻(学名:Oryza sative)是一种谷类作物，属于草本稻属，作为栽培历史最久远的粮食作物之一，已经种植了14000~18000年。水稻作为世界上较为重要的粮食作物，全球超过半数人口都会以水稻作为主食，其中，我国65%的人口，他们的主食就是水稻。中国水稻种植面积3300多万hm²，占全国粮食作物播种面积的1/4，占全世界水稻面积的23%，其产量约占全国粮食总产量的二分之一，占全世界水稻总产量的39%^[3]。可见，水稻的安全生产关乎国家命脉，同时也是国家可持续发展的基础^[4]。近期大量研究发现，异丙隆、绿麦隆、敌草隆和利谷隆等广泛使用的取代脲类除草剂可在以水稻为主的粮食作物中富集，并产生不同程度的药害，甚至死亡^[5-7]。

1.3 敌草隆简介

敌草隆，英文名：Diuron（简称：DU），分子式：C₉H₁₀C_l2N₂O，其化学结构式如图1-1：

图1-1 敌草隆的化学结构式

Fig.1- 1 The chemical formula of diuron

敌草隆是一种取代脲类除草剂，原药为白色粉末，纯的敌草隆药品是呈无色的固体结晶。20℃时，在水中的溶解度为42 mg/L；容易溶解在热的酒精溶液中；在强酸环境下易分解；微溶于乙醇、醋酸乙酯等有机溶液。大鼠急性经口毒性LD₅₀为3400 mg/kg，低毒。受高温分解放出一氧化碳、氮氧化物、氯化氢等有毒气体^[8,9]。

1.3.1敌草隆作用机理及使用现状

敌草隆是一种施用于植物萌芽之前的内吸传导型取代脲类除草剂，被植物根部吸收后向上传导到绿色部分，通过抑制光合作用中的希尔反应，并阻断光合微生物和植物光系统Ⅱ水平的电子转移，使植物不能制造养分，造成植物饥饿而死，达到除草的目的^[10]。敌草隆用于控制各种一年生和多年生阔叶和杂草以及苔藓，如在棉花，甘蔗，苜蓿和小麦等农作物中防除一年生杂草，用量1.8 kg ha^-1 year^-1[11]。由于敌草隆持久性高（1个月到1年），其在农业中的分散导致土壤淋溶污染水生环境，在土壤、沉积物和水等许多环境中都已发现敌草隆^[12,13]。在昆士兰沿岸近岸、荷兰沿海和游艇码头水域以及日本的水生环境中都有不同程度的敌草隆检出量^[14-16]。并且在地表水和底部沉积物中检测到敌草隆及其降解产物^[17]。

1.4植物激素的化学结构及功能

植物的许多组织中都有植物激素的存在，即使是极低浓度的植物激素也能发挥显著的生理功能。能够参与植物生长发育过程：细胞生长、繁殖、性别决定等，这些过程都能够看到植物激素的身影；同时，也能够调节植物对非生物和生物胁迫的响应，增强植物的抗性^[18]。常见的植物激素有生长素（auxin，IAA）、赤霉素（gibberellin，GA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）等，如下图1-2所示：

图1-2 常见的植物激素

Fig.1-2 Common plant hormones

植物在生长发育中的各阶段，植物激素都能够对其进行调控。^[19,20]，例如：在生长素的作用下，植物细胞伸长生长、不定根发生，植物维管束分化，开花结果等生命活动都得到了调控；在细胞分裂素的作用下，植物细胞分裂的同时还可抑制叶片的衰老，在细胞周期、种子发芽、开花结果等生命过程中都有调节作用；此外，除了有促进植物生长的激素，还有一些可抑制植物生长，促进植物休眠的激素，如：脱落酸等。近期研究发现，许多植物激素（如：茉莉酸、水杨酸和油菜素内酯等）与植物抗性相关，是生物或非生物胁迫有效的信号分子。

1.5植物内源激素的检测方法

植物本身所合成的激素含量非常低、性质不稳定，且在细胞内容易受到其他化合物的干扰，导致其性质不够稳定，因此，用于检测植物内源激素的方法要求较严格，需要有高度的灵敏性与专一性。如今，主要的几种检测植物激素的方法有免疫检测、理化检测和生物鉴定等。

1.5.1生物鉴定法

生物鉴定法是最早用于检测植物内源性激素的方法，利用植物内源激素对植株产生生理效应的强度来推算植物内源激素含量。1928 年 Fritz Went^[5-7] 首先建立了检测植物生长素的燕麦芽鞘弯曲测试法，此后，随着 ABA、CTK、GA 等激素的相继发现，相应的各类激素的测定方法也被建立，如燕麦芽鞘弯曲法不仅可以测 IAA 还可以测 ABA。生物鉴定法的优势在于其简便性，能够检测出植物内源激素活性，在使用仪器方面没有较高的要求；但为了获取检测结果的准确性，并使结果保持稳定，在检测时，对检测环境及植物材料的要求很高。由于植物体内存在许多可能影响测定结果的干扰物质，如激素分子类似物、代谢物、拮抗物等^[8]，所以，生物鉴定法所用的植物材料需要有较高的纯度。

1.5.2毛细管电泳法

毛细管电泳法是一项新的分离技术，在测定植物内源激素方面应用较多。毛细管作为分离通道、高压直流电场作为驱动力，使得该法具有了高效、快速、微量的优势^[9]。用此方法研究马铃薯内源激素含量受环境因素影响的情况，最低检测限检测限可小于1.04 mg·L^－1，结果得到植物内源激素的回收率均在91%～109%^[10-11]。

1.5.3气相色谱法(GC)

气相色谱法以气体为流动相，具有分析速度快，灵敏度高和专一性好的特点，因此适用范围非常广泛，可以对所有植物内源激素进行研究分析。该方法的检测器有两种：质量型、浓度型。实验中，多用火焰离子化检测器来分析植物的内源激素。由于GC要求被分析物具有较低的极性和气化温度，除乙烯外的植物内源激素都需要经过衍生化处理生成易挥发的衍生物后才能进行GC分析，衍生化过程繁琐，而且不同的植物内源激素要用不同的衍生方法，增加了样品前处理的工作量，因此，GC法目前主要运用于植物内源激素-乙烯的测定^[14]。

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