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摘 要

虹鳟鱼代替大西洋三文鱼的品种掺假已经成为影响三文鱼鱼肉制品质量安全的重要因素之一。本研究通过多序列比对，设计了虹鳟鱼的特异性引物，建立了基于SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法用于鱼肉制品中虹鳟鱼成分的鉴定。

结果发现：本实验设计的引物能特异性扩增虹鳟鱼（长约为430bp），检出限为0.1ng，而对其他包括大西洋三文鱼在内的非目标物种无扩增信号。市售样品验证发现部分标注三文鱼的产物品来自虹鳟鱼，且与测序结果一致。

本研究建立了一种基于荧光实时PCR技术的快速、准确的虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)鉴定方法，该方法是一种非常快速、简单的检测方法，可用于虹鳟鱼的物种鉴定以及鉴定三文鱼是否存在物种掺假。

关键词：虹鳟鱼 实时荧光定量PCR 物种鉴定 物种掺假

Development of a fluorescent PCR method for Oncorhynchus mykiss identification

Abstract

The adulteration of Atlantic salmon replaced by rainbow trout has become one of the important factors affecting the quality and safety of salmon and fish products.In this study, we designed a specific primer for rainbow trout by multiple sequence alignment, and established a SYBR Green real-time fluorescent quantitative PCR method for the identification of rainbow trout components in fish products.

The results showed that the primers designed in this experiment can specifically amplify rainbow trout (about 430 bp) with a detection limit of 0.1 ng, but no amplification signals for other non-target species including Atlantic salmon. Commercially available samples verified that the portion of the salmon-tagged product was from rainbow trout and was consistent with the sequencing results.

This research established a fast and accurate identification method based on fluorescence real-time PCR technology for rainbow trout. This method is a very fast and simple detection method, which can be used for species identification of rainbow trout and identification of salmon adulteration.

Key Words: Rainbow trout; real-time fluorescent quantitative PCR; species identification Species adulteration

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 虹鳟鱼概述 1

1.2 虹鳟鱼物种掺假 2

1.3 基于DNA的检测方法 2

1.3.1 聚合酶链式反应（PCR） 2

1.3.2 DNA条形码(DNA barcode) 3

1.3.3 实时荧光PCR(Real time fluorescent PCR) 4

1.4 目的意义 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 鱼类样品 5

2.2 实验仪器 6

2.3 实验仪器 6

2.4 实验方法 7

2.4.1 DNA提取与纯度测定 7

2.4.2 物种鉴定 7

2.4.3 引物设计与特异性验证 8

2.4.4 引物检测灵敏性验证 9

2.4.5 市售样品验证 9

第三章 实验结果与分析 10

3.1 DNA提取 10

3.1.1 标准品DNA的提取结果 10

3.1.2 市售样品DNA的提取结果 11

3.2 引物设计与特异性验证 13

3.2.1 特异性引物设计 13

3.2.2 引物特异性验证 13

3.3 引物检测灵敏性验证 16

3.4 市售样品验证 17

第四章 结果与展望 19

4.1 结果 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

1.1 虹鳟鱼概述

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)又名瀑布鱼、七色鱼，属硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲑形目(Salmoniformes)，鲑科(Salmonidae)，太平洋鲑属(Oncorhynchus)的一种冷水性鱼类^[1]。该物种经常作为一种重要的硬骨鱼研究模型以及水产养殖物种^[2]。因成熟个体沿侧线有一条棕红色纵纹，似彩虹，故名。

虹鳟鱼为淡水鱼，对水质指标同样有较高的要求，其生长的最适pH值为6.5~6.9，最适温度为16℃至18℃。在自然界中，水量充沛、溶氧量好，可以耐受24℃的水温，但在人工养殖池塘内，水温达到22℃就有衰竭死亡的危险^[3]。虹鳟鱼对水的溶氧量要求较高。其溶氧量致死点为3mg/L。想要保证虹鳟鱼良好的生长状态，溶氧量应控制在6mg/L以上，当溶氧量为9mg/L以上可快速成长。在水温较低、溶解氧含量较高、流量充沛的水域，其水体生化需氧量小于10mg/L，氨氮值低于0.5mg/L，pH值6.5~6.9，此时虹鳟鱼生产繁殖状况良好^[4]。虹鳟鱼在浑浊的水中摄食活动停止，繁殖发育受到阻碍并有可能出现死亡。另一方面，随个体的增长虹鳟鱼对盐度的适应能力也会增强，通常超过35g的个体可以通过微咸水的过渡转变来适应海水生活^[5]。由此可见，虹鳟鱼对于水质的要求是比较高的，借此可以推断出其食用品质较高且安全性有所保障。虹鳟鱼的美味与营养已被越来越多的人们所认可，在食品餐饮行业已经成为当今世界餐桌上的新宠食材，我国食用虹鳟鱼的场所主要在餐厅，市场上用虹鳟鱼加工的品种相对较少，且味道单一，加工方式主要是以西式烟熏为主^[6]。

据统计，我国冷水鱼年产量均在7×10⁴t左右，2011年渔业年鉴调查总结我国冷水鱼养殖产量达到6×10⁴t，其中虹鳟鱼1.64×10⁴，我国全年可提供鲑鳟苗种6.8×10⁷粒，近年来随着鳟鱼养殖产业生产规模扩大，鳟鲑鱼年产量均近4×10⁴t，总产值约合10亿元^[7]。虹鳟鱼被很多国家进行人工养殖，我国青海省等地也有虹鳟鱼养殖基地，给当地人民带来了较大的经济收益。然而不可避免的是，虹鳟鱼掠食性强，一定程度上也给生态系统带来了危害，如红鳟鱼的入侵会可能占据本地鲑科鱼类的生态位，造成其他鱼类种群数量减少^[8]。

1.2 虹鳟鱼物种掺假

2018年8月10日，中国水产流通与加工协会会同三文鱼分会成员单位青海民泽龙羊峡生态水殖有限公司、上海荷裕冷冻食品有限公司等十三家单位共同起草的《生食三文鱼》团体标准正式发布：三文鱼是鲑科鱼类统称，包括大西洋鲑、虹鳟鱼、银鲑等^[9]。

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