摘 要

海藻糖是一种广泛存在于各种生物体内的非还原性双糖，是唯一被美国FDA认证的安全的功能性低聚糖，在食品、医药、农业、化妆品等领域均具有广阔的潜在应用。目前研究最简单的生产方法是由麦芽糖经海藻糖合成酶一步反应制备海藻糖，但原料麦芽糖需要经过淀粉酶解制备。本文利用PCR技术扩增β-淀粉酶基因（BA）、海藻糖合成酶基因（Tre），构建诱导型质粒pETDuet-BA-Tre,导入宿主细胞E.Coli BL21(DE3)，获得能同时表达β-淀粉酶基因和海藻糖合成酶基因的重组菌BA-Tre-pETDuet-BL21(DE3)，以实现双酶耦合催化淀粉制备海藻糖，简化工艺流程，降低生产成本。通过高效液相色谱法（HPLC）测定β-淀粉酶和海藻糖合成酶的酶活，分别为4U/ml、9.8U/ml；以淀粉为底物进行催化反应，验证了双酶耦合催化制备海藻糖是可行性的。

关键词：共表达 β-淀粉酶 海藻糖合成酶 海藻糖

Cloning and coexpression of β-amylase gene and trehalose synthase gene

Abstract

Trehalose is a non-reducing disaccharide in various organisms. As the only functional oligosaccharide that has been certificated by FDA, trehalose is widely used in the field of food, pharmaceutical, agriculture and cosmetic industries. Until now, the simplest trehalose production method is using trehalose synthase (Tre) to catalyze maltose into trehalose. However, maltose is prepared by the hydrolysis of starch. In this study, β-amylase gene (BA) and trehalose synthase gene (Tre) have been successfully amplified by PCR and inserted into pETDuet-1 to construct recombinant plasmid BA-Tre-pETDuet-1. Then, this recombinant plasmid was transformed into the host E. Coli BL21(DE3) to achieve the objective of brief technological process and low-cost, using double enzyme coupling catalysis for the trehalose synthesis. The activities of β-amylase and trehalose synthase are 4.16U/ml and 20U/ml, which are measured respectively by high performance liquid chromatography (HPLC). The feasibility of double enzyme coupling catalysis with starch as a substrate is verified.

Key words: Cloning, Coexpression, β-amylase, Trehalose synthase

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2海藻糖的性质 1

1.3海藻糖的应用 2

1.3.1在食品工业上的应用 2

1.3.2在农业方面的应用 3

1.3.3医药工业的应用 3

1.3.4化妆品方面的应用 3

1.4海藻糖的生产与制备 3

1.4.1微生物抽提法 4

1.4.2微生物发酵法 4

1.4.3酶转化法 5

1.5本课题的研究意义 6

第二章 实验材料 8

2.1 实验仪器 8

2.2 实验药品 9

第三章 实验方法 11

3.1 质粒与菌株 11

3.2 培养基 11

3.2.1 培养条件 11

3.2.2 培养基配方 11

3.3 实验方法 11

3.3.1 引物设计 11

3.3.2β-淀粉酶（BA）和海藻糖合成酶（Tre）基因的扩增 12

3.3.3 琼脂糖凝胶电泳 12

3.3.4 β-淀粉酶（BA）和海藻糖合成酶（Tre）基因的纯化 13

3.3.5 目的基因与T载体连接 13

3.3.6 重组质粒的转化 13

3.3.7 菌落PCR与测序 13

3.3.8 重组质粒BA-pETDuet的构建 14

3.3.9 构建BA-Tre-pETDuet重组质粒 15

3.3.10 SDS-PAGE 16

3.3.11 酶活测定 17

3.3.12 双酶耦合催化制备海藻糖的催化体系构建 19

第四章 实验结果与讨论 21

4.1 BA基因的克隆与重组质粒BA-pETDuet的构建 21

4.2 重组菌BA-pETDuet- E.Coli BL21（DE3）的表达 23

4.3 β-淀粉酶的酶活测定 24

4.4 Tre基因的克隆与重组质粒BA-Tre-pETDuet的构建 25

4.5 重组菌BA-Tre-pETDuet- E.Coli BL21（DE3）的表达 26

4.6海藻糖合成酶的酶活测定 27

4.7 双酶耦合催化制备海藻糖可行性分析 28

第五章 结论与展望 30

参考文献 31

致谢 33

第一章 文献综述

1.1引言

海藻糖（C₁₂H₂₂O₁₁），又称酵母糖，是两个吡喃葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合形成以α-1,1糖苷键连接的非还原性双糖。海藻糖具有较为稳定的化学性质使其在酸性碱性环境中都能保持稳定。海藻糖对生物体具有非还原性和良好的保水性质，当在生物体处于恶劣环境时能在蛋白质和生物膜表面形成一层独特的防护膜，防止蛋白质和生物膜变性失活，从而使生物体能够表现出正常的生命体征。由于其独特的生理体征，海藻糖在食品、医药、农业和化妆品的领域被广泛开发应用。现阶段海藻糖产业化生产的主流方式是通过海藻糖合成酶将α，α－1，4－麦芽糖转变为α，α－1，1－海藻糖，但原料麦芽糖还需经过淀粉水解获得。目前已有研究表明利用β-淀粉酶与海藻糖合成酶融合表达直接将淀粉转化成海藻糖是可行的。因此本课题旨在研究通过基因共表达的方法获得重组大肠杆菌，可以直接将淀粉转化为海藻糖。

1.2海藻糖的性质

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α-1,1糖苷键连接形成的，具有三种光学异构体即α,α型 、α,β型 和β,β型，而一般生物体内最常见的是α，α型。带有两分子结晶水的海藻糖是自然界中最常见的，但当温度达到130℃之后海藻糖化合物带的两分子结晶水会受热丢失。

海藻糖的基本性质具体如下：

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