前言

磷是植物生长发育不可缺少的营养元素之一，土壤中的磷绝大部分呈有机或无机磷化物状态，植物不能直接吸收。解磷微生物通过自身代谢可促进难溶磷的溶解，使之变为可供植物直接吸收利用的磷形态，同时，还可降低肥料成本，对环境进行微生物修复，提高作物产量。并且，其降解产物在食品生产方面也有重要作用。本课题在完成产物分析的基础上对其培养条件及降解条件进行独立的研究，期望能通过实验判断其发酵过程和降解过程是否具有偶联性，完成单因素优化实验，为正交试验及高密度培养提供有效可靠的理论数据。

1.解磷微生物的概述

1.1解磷微生物

解磷微生物自1908年被Sackeet发现和报道以来，至今已有近100年的研究历史。经历了以下研究阶段：对解磷微生物的认识、高效解磷菌筛选、解磷能力测定、大田效果检验、大田施用、解磷机制研究和解磷微生物的基因工程改造^[1]。解磷微生物（PSM）是一类能够将植物难以吸收利用的磷转化为可利用形态的微生物，可促进植物对磷的吸收，使植物能够适应酸性、缺磷等不良环境^[2-3]。除细菌外，真菌和放线菌也具有解磷的能力，而且真菌的解磷能力普遍较强，在植物根际的解磷微生物数量远比非根际土壤多。

1.2解磷作用及机理

微生物的解磷机制复杂多样，因菌株的不同而有所不同。目前，关于微生物的解磷机制，有以下观点被人们普遍接受。（1）通过生命代谢活动产生有机酸（细菌一般分泌乳酸、氨基酸、草酸、延胡索酸、琥珀酸和柠檬酸等，真菌主要分泌草酸、丙二酸和乳酸等）^[4]，Sperber 等^[5-7]研究表明，解磷细菌产生的有机酸主要有生乳酸、羟基乙酸、延胡索酸、琥珀酸和α-酮基葡萄糖酸，这些有机酸，既能降低培养介质的pH 值，又能与Ca² 、Fe³ 、Fe² 、Al³ 等离子螯合而使难溶性磷酸盐溶解^[5]。有机酸机制溶磷作用与分泌酸的种类、数量、机制缓冲性能、磷酸根螯合离子数量等有关，尤其受土壤中钙离子数量的影响^[6]。（2）微生物的解磷作用主要是由于在其代谢过程中分泌质子的缘故，使介质的pH 值降低，从而使磷矿粉溶解。Asea发现一些解磷菌只有在介质中有NH⁴ 存在时，才具有溶解无机磷酸盐的能力。但是，赵晓蓉发现，虽然微生物解磷与培养液中pH 值存在一定相关性，但降低pH 值并不是微生物解磷的必要条件^[5-6]。（3）解磷真菌对土壤中难溶有机磷的溶解主要通过酶解作用。当环境中的磷低于一定含量时，微生物在代谢过程中就可以分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶物质，将有机磷降解，释放出植物可吸收利用的磷。微生物的这种酶解作用易受环境条件的影响，微碱性环境下更适于其发挥作用。产生有机酸和酶解作用是目前微生物解磷的主要机制，有些微生物也可通过呼吸作用产生CO₂ 或在NH 同化时释放质子使介质pH 值下降从而溶解钙磷酸盐。磷细菌释放H₂S 与磷酸铁作用也可以达到溶磷的目的^[7]。从目前的研究来看，微生物解磷机制比较复杂，对它的研究今后还需加强。

2.国内外解磷微生物菌的研究应用概况

2.1国外解磷微生物的研究应用概况

国外对解磷微生物的应用研究开展的比较早。早在20 世纪初期，欧洲相继有人研究了土壤中微生物转化磷元素的过程。1935 年，前苏联学者蒙基娜从土壤中分离得到一种具有解磷能力的巨大芽孢杆菌可以分解卵磷脂( B．megaterium var． phosphaticum) 和核酸，于1947 年她大量生产该菌并将其广泛应用于前苏联以及东欧各国，据报道接种该解磷菌后土壤中P₂O₅利用率提高15%以上^[8]。SundaraRao和Sinha 利用Ca₃ (PO₄ )₂作为磷源, 经过14 d的摇瓶培养, 发现几株芽胞杆菌属释放的可溶性磷达70.52 ～ 156.80 μg/mL, 埃希氏菌属为59.70 ～ 170.30 μg/mL^[9]。印度农业研究所于1996－1999 年间在印度新德里研究了解磷微生物对磷吸收以及水稻和小麦产量的影响，结果显示，水稻和小麦对磷的吸收以及水稻和小麦的粮食和秸秆的产量在加入溶磷菌的情况下均有所增加^[8，10]。Narsian和Patel 对4株酵母菌(Saccharomyces)Ca₃(PO₄)₂和磷矿石的溶解能力进行了研究, 结果表明NH⁴ 离子不是所有菌必需的氮源, 一些菌株以NO^3-为最佳氮源, 说明解磷作用不只是H 作用的结果^[9]。Chabot等人研究了几株溶磷菌对农作物生长的影响，结果显示这几株菌可以促进西红柿、马铃薯、洋葱、香蕉、咖啡、柑橘等可栽培作物含量的提高，古巴已将其制成生物菌肥。Heisinger 和Vessey于2001 年在加拿大的两个地区用菌株( P.bilaii) 接种豌豆，对其根长、根形态等参数的研究也表明该菌株具有强大的解磷能力，加拿大已将该菌制成的菌剂商品化生产^[10]。

2.2国内解磷微生物的研究应用概况

我国磷细菌的研究起步较晚，始于20 世纪50 年代，解磷细菌应用研究始于60 年代^[8]。1950年, 前东北农科院从东北黑土和灰化土中分离出能分解有机磷的巨大芽孢杆菌。同年, 中国科学院前林业土壤研究所从东北黑土中分离出一种假单胞菌。1955 年，陈廷伟等从北京小麦根际土壤中分离出一种产酸性无孢子杆菌, 具有较强的溶解磷酸三钙的能力。接种该菌的玉米及谷子沙培试验表明:玉米干物重比对照增加了32% -45% , 谷子干物重比对照增加了51%。孙华、熊德祥研究了施用有机肥料和溶磷细菌肥料对砂姜黑土磷素形态转化的影响, 表明施用溶磷细菌肥料,可提高土壤中等活性有机磷和活性有机磷含量, 也能促进土壤中Ca8 -P、Ca10 -P向Ca2 -P、Al-P和Fe-P转化,从而提高土壤有效磷含量。林启美等以磷矿粉作为唯一的磷源培养解磷微生物, 发现解磷能力较强的菌株为假单胞杆菌属(Pseudomonas)和欧文氏菌属(Erwinia), 真菌的解磷能力比细菌强, 几株解磷能力较强的细菌溶解磷矿粉的量为26.92 ～ 43.34 μg/mL, 而大多数真菌则为59.64～ 145.36 μg/mL ^[8-10]。20 世纪80 年代以后，国内许多单位相继开发出了由多种芽孢杆菌组成的复合解磷菌剂，但使用的效果并不理想。直到近几年，随着农业可持续发展战略的实施和人们环境保护意识的增强，微生物肥料的研究及开发得到了高度重视，科学工作者在研究微生物肥料调控土壤肥力及对改善土壤环境等方面的作用进行了大量的工作，从而使微生物在提高土壤养分利用率上发挥着巨大作用。到目前为止，我国已有生物肥料生产企业500 多家，而且基本上都进行解磷微生物肥料的生产 也已被用作微生物肥料，施用于多种植物。

3.培养及降解条件的研究

3.1培养条件的研究

3.1.1不同碳源对菌体数量的影响

分别用0.5%的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等作碳源，于35℃、150r/min^[11]的条件下，对该菌株进行摇床培养，培养24h，确定最适碳源。

3.1.2不同氮源对菌体数量的影响

分别用1%^[12]的蛋白胨、硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、尿素、等作氮源，于35℃、150r/min的条件下，对该菌株进行摇床培养，培养24h，确定最适氮源。

3.1.3不同碳氮比对菌体数量的影响

在选出最适碳氮源的情况下，分别用2:1、1:1、1:2的碳氮比，于35℃、150r/min的条件下，对该菌株进行摇床培养，培养24h，确定最适碳氮比。

3.2降解条件的研究

3.2.1温度对解磷效果的影响

在摇床不同温度条件下，分别测定实验菌的解磷能力。找出解磷率最高的降解温度，即为该实验菌最适的降解温度^[13]。

3.2.2无机盐对解磷效果的影响

实验菌株对不同种类的无机盐吸收不同，解磷能力也有所不同。在降解过程中，分别添加1%的钠盐、钾盐、铁盐等，测定实验菌的解磷能力，确定最优无机盐^[14-15]。