摘 要

近年来，稀有单糖在食品、保健、医药等领域的诸多应用，引起人们越来越多的关注，例如它们作为低热量的甜味剂的使用，以及膨化剂、抗氧化剂、糖苷酶抑制剂、核苷类似物等。大多数糖异构酶是来转换单糖的，但是糖异构酶本身能高效的生成各种各样的单糖。近日，磷酸糖异构酶作为一种生产各种单糖的酶被提及，它们不仅能转化原本的天然底物磷酸化单糖底物，而且能转换与它有相似结构的单糖。

在所有的戊糖和己糖中，该酶对催化L-核酮糖生成L-核糖表现出最高的活性，而L-核糖是一种潜在药物中间原料。我们对来自于Thermus aquaticus可能编码甘露糖-6-磷酸异构酶的未知基因，进行了克隆并在大肠杆菌中进行表达，研究了它的酶学性质和对L-核糖的生物转化性能。

关键词: 稀有糖 甘露糖-6-磷酸异构酶 L-核糖

Abstract

Recently, rare monosaccharides have attracted much attention in the food, nutritional, and pharmaceutical industries due to their many applications, including their use as low-calorie sweeteners, bulking agents, antioxidants, glycosidase inhibitors, and nucleoside analogs. Many sugar isomerases that convert monosaccharides have been characterized.However, sugar isomerases themselves are sufficient to produce various types of monosaccharides more efficiently. Recently, sugar phosphate isomerases have been suggested as useful enzymes for producing various monosaccharides because they convert not only the authentic substrate sugar phosphate but also the substrate sugar that have a similar configuration.

Among all of the pentoses and hexoses evaluated, the enzyme exhibited the highest activity for the conversion of L-ribulose to L-ribose, a potential starting material for many L-nucleoside based pharmaceutical compounds. An uncharacterized gene from Thermus aquaticus, thought to encode a mannose-6-phosphate isomerase,was cloned and expressed in Escherichia coli. Its substrate specificity and bioconversions of L-ribose were investigated.

Key words: rare monosaccharides; mannose-6-phosphate isomerase; L-ribose

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 稀有单糖简介 1

1.3 L-核糖的医药应用 1

1.3.1 医药应用 1

1.4 L-核糖的制备及催化酶 2

1.4.1 化学合成法 2

1.4.2 由糖类物质生物转化制备L-核糖 2

1.4.3 相关催化酶 3

1.4.4 L-核糖的生产现状 3

1.5 课题展望 3

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 基因与质粒 5

2.1.2 实验仪器及试剂 5

2.1.3 培养基，培养条件，基因组提取及质粒提取 6

2.1.4 PCR反应 6

2.1.5 目的片段manA与载体质粒pET28a( )连接并转化 6

2.1.6 重组蛋白诱导表达后SDS-PAGE检测、纯化及酶活初测。 7

2.1.7 酶学性质测定 7

2.1.8 MPI酶活检测 8

第三章 结果与讨论 9

3.1 T. aquaticus甘露糖-6-磷酸异构酶序列比对 9

3.2 酶分子量测定 9

3.3 金属离子，pH，温度的影响 9

3.4 Thermus aquaticus MPI底物特异性 11

3.5 Thermus aquaticus MPI催化L-核糖条件优化 13

第四章 结论与展望 16

4.1 结论 16

4.2 展望 16

参考文献 18

致 谢 22

第一章 文献综述

1.1 引言

近年来，以L-阿拉伯糖为原料制备L-核酮糖或L-核糖通过生物酶法成为了最热的研究方向。L-核糖作为医药前提，具有极大的经济价值，而L-阿拉伯糖是一种来源广泛的单糖。近年来，稀有单糖在食品、保健、医药等领域的诸多应用，引起人们越来越多的关注。例如它们作为低热量的甜味剂的使用，以及膨化剂、抗氧化剂、糖苷酶抑制剂、核苷类似物等。大多数糖异构酶是来转换单糖的，但是糖异构酶本身能高效的生成各种各样的单糖。近日，磷酸糖异构酶作为一种产各种单糖的酶被提及，因为它们不仅能转化原本的磷酸糖底物，而且能转换与它有相同配置结构的底物糖。

随着基因工程技术的迅速发展，利用分子克隆和外源表达技术可以大幅度地提高某种工业酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株具有普通微生物难以企及的酶催化效率；利用基因重组菌生产L-核糖的工艺报道依然很少，我们通过基因序列对比，从美国国家生物技术信息中心基因数据库中筛选了来自Thermus aquaticus嗜热栖热菌作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了甘露糖-6-磷酸异构酶(MPI) 的潜在编码基因manA，利用大肠杆菌作为宿主，成功构建了能够高效表达甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌。

1.2 稀有单糖简介

稀有单糖是属于稀有糖类其中一种，它目前作为一种新型的具有功能性的甜味剂应用于生产生活。随着生活的发展人类的进步人类逐渐发现单糖和其衍生物在生理功能上有很大的相似功能，稀有单糖的意义被从新定义。稀有糖在自然界中含量极其稀少但这些糖在饮食，生活，医药等地方起到了非常重要的作用及地位。例如，D-阿洛酮糖作为食糖替代品是一种低能量不消化的；D-塔罗糖具有低能量低吸收，改善肠道菌群等优点；D-阿洛糖具有抑制癌细胞增殖功能；D-木糖醇具有降血糖，改善肝功能，减肥等功能；而L核糖可以作为各种化学产品药品的生产原料。

1.3 L-核糖的医药应用

1.3.1 医药应用

L-核糖在医学中有着重要的作用，通过L-核糖合成其衍生物作用在医学上有着不可估量的医学价值。其作用表现在，异常细胞的繁殖能力较正常细胞旺盛，但是它们的识别能力较正常细胞差，L-核糖核酸能被异常细胞利用使得繁殖细胞在转录时遗传信息发生错误信号，进而起到抗癌和抗病毒的作用，L-核糖的良好抗病毒生理功能及对正常细胞毒副作用小的优点使其能很好应用于医药治疗过程。L-对映体已广泛用作抗病毒核苷类似物在治疗重症病毒性肝炎中的应用。由于其强大的生物活性和较低的疾病毒性，与D-核苷酸类药物相比优势明显。L-核糖，是一种稀有戊糖，可作为合成前体抗病毒药物如核苷衍生物，L-核糖在医药方面起到重要的作用，L-核糖其衍生物主要医学应用在抗病毒，同时在抗肿瘤的治疗方面也有极大的作用。并且它对人体细胞的危害很低同时还可以产生核糖纯作用在医药治疗上。L-核糖组分的糖复合物是一些基础糖单元的重要组成成分，例如糖蛋白和糖脂类物质，而这些物质在机体内有着极其重要的作用，提供机体能量或作为细胞识别的载体。

1.4 L-核糖的制备及催化酶

1.4.1 化学合成法

L-核糖的化学合成通常以较廉价的糖为原料，如将L-阿拉伯糖C-2位置羟基的构型翻转即可得到L-核糖。实现这一翻转的方法有两种。现在L-核糖的制备主要还是依赖于化学合成法，化学合成法的优点在于效率以及合成过程中的各个方面都已经提高了很多，但是还是存在很多问题；如在合成的过程中步骤很多，效率低下以及昂贵的试剂消耗。同时化学合成法的工艺相对来说过于复杂还要使用有机溶剂以及一些副产物是对环境有害的。很难适应工业化生产量化的要求[11]。

1.4.2 由糖类物质生物转化制备L-核糖

生物技术通过这些年的不断发展对合成L-核糖的研究已经开始通过微生物的发酵来制备，并且这样的制备方法已经被广泛的使用和认可。而且这样的制备方法会更加的方便也会有更少的危害对环境，这样的制备方法又称生物合成法。主要是以L-阿拉伯糖为原料通过微生物及其酶生产L-核糖的方法。微生物合成的反应条件要求简单，反应过程处理也方便，最主要是相对于化学合成法，生物合成法可以改善以前的合成方法带来的环境问题。

L-核酮糖、L-阿拉伯糖是生物合成法对糖类起始物研究的主要俩种糖类。转化过程的催化酶包括L-AI、MPI等[13]。转化方式虽然不同但有着共同的特点。L-核糖的制备可以通过细菌体转化或者通过酶转化，它们的特点都是经过几个步骤的反应，先通过L-阿拉伯糖反应得到L-核酮糖，然后直接反应L-核酮糖的到L-核糖