文 献 综 述

1.1 概述

谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, EC4. 1. 1. 15,简称GAD)是磷酸吡哆醛(pyridoxal 5#8217;-phosphate, PLP)依赖型酶,催化谷氨酸(glutamic acid, Glu)脱羧生成γ-氨基丁酸 (aminobutyric acid, GABA)^[1]。GAD在体内通过PLP与脱辅基酶蛋白的解离和聚合而调节GAD酶的活性。^[2]GABA作为一种非蛋白的功能性氨基酸，是动物中枢神经系统中重要的神经递质，具有重要的生理功能，例如增强肝、肾功能；防止高血压、动脉硬化和心律失常；消除睡眠障碍等^[3]。在GABA生产中，GAD起到了关键性作用，它作为一种不稳定的游离酶，其内在氨基酸结构或者外界化学微环境的变化都会导致酶活下降甚至失活^[4]。酶的固定化技术可使游离酶的稳定性差、难回收等问题得到解决^[5]。本研究旨在研究固定化GAD的稳定性，为其实际应用提供依据。

1.2 GAD固定方法及研究进展

酶的固定化是指通过物理或化学方法将酶束缚在一定空间内制成仍具有催化活性并可回收重复使用的酶或酶的衍生物^[6]。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足，具有易于使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点^[7]。现阶段，主要的固定方法有吸附法，包埋法，共价结合法。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法较简便, 酶活损失小, 但酶与载体作用力小，易脱落^[8]。包埋法即酶在载体中发生聚合、沉淀或凝胶化。该方法操作简单, 但固定后酶活力不高, 固定化酶的牢度低^[9]。现已有以海藻酸钠为载体固定GAD的研究^[10]，固定后GAD稳定性得到一定的改善，但重复利用次数较少。共价结合法一般将载体有关基团活化, 然后与酶有关基团发生共价偶联反应。吸附法和包埋法具有操作简单的优点，但是吸附法酶与载体的吸附力小，易脱落。而包埋法则机械强度较低。综合比较后不难发现，共价结合法则具有结合牢固、结合效率高的优点，因此，我们选用共价结合法来固定谷氨酸脱羧酶，得到固定化谷氨酸脱羧酶（简称IGAD）。

1.3 双醛淀粉和壳聚糖载体在酶固定化中的应用

共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱落的优点, 但反应条件苛刻、操作复杂、酶活回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化^[11]。基于抗凝血生物材料表面性质与结构的关系提出的”维持正常构象”假说^[12]及在多肽合成技术中阐述的柔性链的作用机理，有人提出了酶的”柔性固定化”的模型^[13]，即：在固定化载体上连接亲水分子链，使其更加柔顺具有亲水性。该亲水链可以保持酶原有的构象并维持其活性。因此，该方法既可以使固定化酶结合牢固，又可改善其固定化过程中酶活损失较大的问题，还可最大可能地保留酶原有的活性，具有较好的研究价值和应用前景。此外，目前已有研究的柔性链主要是双醛淀粉(dialdehyde starch, DAS)可直接应用于以食品级GABA生产为目的酶固定化技术中。

以壳聚糖(Chitosan)为载体（壳聚糖(Chitosan，简称CS)是天然的碱性氨基多聚糖，甲壳素的N-脱乙酞基的产物，由2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖以β(l→4)糖苷键连接而成），双醛淀粉(DAS)为柔性链对木瓜蛋白酶进行固定化，结果所得的固定化酶的活性，储藏稳定性，半衰期，最适温度等均有所提高。因此，本文采用由壳聚糖为固定化的载体、双醛淀粉为交联剂固定GAD，最后用其所得的GAD来测定其稳定性。