文 献 综 述

1.1 前言

大蒜（Allium Sativum L.）为百合科葱属植物蒜的鳞茎，二年生植物。其营养价值很高，含有蛋白质、糖类、脂肪和维生素、钙、磷、铁、硒、锗等矿质元素[1,2]（表1，表2），还含有多糖、凝集素[3,4]和一些酶类（如蒜氨酸酶、过氧化物酶、γ-谷氨酰转肽酶等）[5,6]。大蒜中主要的生物活性物质是大蒜所特有的含硫化合物，这些含硫化合物赋予了大蒜很高的药用价值，如抗癌防癌、降血压、降胆固醇、抗氧化、抗肿瘤、抗血小板聚集、降血脂和抗动脉粥样硬化、保护心血管、降低血糖等作用[5]。大蒜的休眠期短，易发芽霉变和品质劣变，长期贮藏损耗率较高[7]。大蒜除鲜食外，常加工成蒜片、蒜粉、黑大蒜、蒜泥等。但是大蒜制品在加工过程往往中会出现绿变的现象，这一定程度上影响了产品的外观质量，妨碍了大蒜进行二步加工。而大蒜绿变与其生理休眠状态有关，处于休眠的大蒜，其蒜泥不会发生变绿现象，结束休眠大蒜的蒜泥会变绿[8,9,10]。因此，研究处于不同生理期的大蒜，对探究抑制大蒜绿变的途径、大蒜规模化加工生产具有重要意义。

表1 新鲜大蒜鳞茎中主要成分的含量（g/100g-WM）

Table 1 The content of main components in fresh garlic

水分	蛋白质	脂肪	糖类	粗纤维	挥发油	灰分
70	4.4	0.2	23	0.7	0.2	1.3

表2 新鲜大蒜鳞茎中微量成分的含量（mg/100g-WM）

Table 2 The content of minor components in fresh garlic

钙	磷	铁	硒	锗	SOD	维生素B1	维生素B2	维生素B3	维生素C
5	44	0.4	0.044	75.4	17.6	0.24	0.03	0.9	3

1.2 大蒜绿变反应过程

在非休眠状态或者低温（≤12 ℃）贮藏18 d以上，大蒜会发生绿变，其反应过程如图1所示。大蒜绿变反应过程可分为8个阶段：①γ-谷氨酰-S-烯基-L-半胱氨酸（C8H13SN2O5R）在γ-谷氨酰转肽酶的作用下水解为谷氨酸（C5H9NO4）和S-烯基-L-半胱氨酸（C3H6SNO2R）；②S-烯基-L-半胱氨酸在H2O2或氧化酶的作用下氧化成S-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜（C6H11SNO3）和S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜（C6H11SNO3）[11]；③S-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜在蒜氨酸酶的作用下分解成1-丙烯基次磺酸（C3H6SO）、丙酮酸（C3H4O3）和氨（NH3），同时，1-丙烯基次磺酸进一步聚合成醚溶性的二丙烯基硫代亚磺酸酯（C6H10S2O），即色素中间体[12, 13]；④二丙烯基硫代亚磺酸酯和氨基酸（HA）反应，生成醚不溶性的吡咯基氨基酸（C8H10NO2R），又称作色素前体；⑤S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜在蒜氨酸酶的作用下转化为2-烯丙基次磺酸（C3H4O3）、丙酮酸和氨，2-烯丙基次磺酸通过聚合反应生成二烯丙基硫代亚磺酸酯（C6H10S2O），即大蒜辣素；⑥吡咯基氨基酸和二烯丙基硫代亚磺酸酯反应生成蓝色素[14]；⑦蓝色素不稳定，会降解为黄色素；⑧蓝色素和黄色素混合呈现绿色[15]。由此可知，大蒜绿变反应受γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶的调控。

图1 大蒜绿变反应过程

1.3 γ-谷氨酰转肽酶

γ-谷氨酰转肽酶在生物体分布相当广泛，是存在于从细菌到哺乳动物体内的参与谷胱甘肽循环和氨基酸跨膜转运的异二聚体酶，它由一个40 kD大亚基和一个约20 kD的小亚基构成[16]。

1.3.1 催化反应类型

大蒜含有γ-谷氨酰-S-烷（烯）基-L-半胱氨酸等含硫成分，其中参与大蒜绿变反应的主要是γ-谷氨酰-S-烯基-L-半胱氨酸[17]。它在膜结合酶γ-谷氨酰转肽酶的催化作用下[18]，可以发生水解反应和转肽反应。

（1）水解反应 以水为受体，将γ-谷氨酰基从供体分子γ-谷氨酰-S-烯基-L-半胱氨酸（C8H13SN2O5R）转移到水分子上，形成谷氨酸（C5H9NO4）和S-烯基-L-半胱氨酸（C3H6SNO2R），即：

C8H13SN2O5R H2O→C5H9NO4 C3H6SNO2R

其中，R代表含烯基的脂肪烃。

（2）转肽反应 以氨基酸或氨基酸衍生物（HA）作为受体，将γ-谷氨酰基从供体分子转移到氨基酸残基上，形成含谷氨酸残基的肽（C5H8NO3A）和S-烯基-L-半胱氨酸（C3H6SNO2R），即：

C8H13SN2O5R HA→C5H8NO3A C3H6SNO2R

其中，HA代表氨基酸残基或肽。

由于大蒜绿变的pH通常在6.0左右，γ-谷氨酰-S-烯基-L-半胱氨酸容易发生水解反应，此时γ-谷氨酰转肽酶起水解酶的作用。

1.3.2 酶学性质

γ-谷氨酰转肽酶酶动力学研究表明，在最适反应条件下的动力学常数Km和Vmax分别为10.83 mmol/L和28.65 u/L；γ-谷氨酰转肽酶的酶促反应在30-180 min内基本呈线性关系。该酶在50 ℃以下具有较好的稳定性，最适反应温度为37℃，在pH 8.0~9.0有较好的稳定性，最适pH值为8.5。不同的金属离子，对γ-谷氨酰转肽酶的作用不同，Ca2 、Mg2 对γ-谷氨酰转肽酶的活力有促进作用，Al3 、K 、Na 对酶活力影响不大，其他的金属离子表现出不同程度的抑制作用[16]。

1.3.3 与大蒜绿变的关系

大蒜在非休眠或是低温贮藏（≤12 ℃）时，容易发生绿变。Cho.J等人在大蒜中克隆出γ-谷氨酰转肽酶，并发现大蒜的γ-谷氨酰转肽酶基因序列与洋葱的相似度为92%。γ-谷氨酰转肽酶基因表达受贮藏温度影响较大，低温条件下γ-谷氨酰转肽酶基因表达较强，当温度≥20 ℃时，表达受到抑制[11]。另一方面，在不能绿变的蒜泥中加入该酶，蒜泥会绿变。因此可以推测，γ-谷氨酰转肽酶与蒜泥绿变有着密切的关系。虽然γ-谷氨酰转肽酶不直接参与大蒜绿色素的生成，但参与大蒜体内生理变化反应，提供大蒜绿变所需的成分。

1.4 蒜氨酸酶

蒜氨酸酶是存在于大蒜中的一种内源酶，其化学名称为S-烷基-L-半胱氨酸亚砜酶，又称蒜氨酸裂解酶、蒜酶、C-S酶等。大蒜中蒜氨酸酶为二聚体，大约占大蒜中可溶性蛋白质的10%~12%[19]。其辅酶因子是5'-磷酸吡哆醛，位于酶的活性配置位点。

1.4.1 催化反应类型

在完整的细胞内，亚砜类化合物和蒜氨酸酶分别存在于细胞质、液泡中。当细胞受损时，蒜氨酸酶就会和这些底物接触，发生反应[19]。

S-烃基-L-半胱氨酸亚砜（C3H6NSO3R）在蒜氨酸酶及其辅酶5'-磷酸吡哆醛的协同作用下，发生β-消除反应，产生丙酮酸（C3H4O3）、氨以及次磺酸（R-SOH），即：

C3H6NSO3R H2O→NH3 C3H4O3 R-SOH

次磺酸不稳定，通过聚合反应，自发缩合成硫代亚磺酸酯（R2S2O），即：

2R-SOH→R2S2O H2O

其中，R代表甲基、丙基、烯丙基、丙烯基。

产生的硫代亚磺酸酯作为色素中间体，与氨基酸反应，形成色素前体。

1.4.2 酶学性质

蒜氨酸酶有多种底物S-甲基、S-乙基、S-丙基、S-丁基和S-烯丙基半胱氨酸亚砜都可作该酶的底物，S-烯丙基半胱氨酸亚砜即蒜氨酸是天然底物。从鲜蒜中提取得到的蒜氨酸酶以L-蒜氨酸为底物酶的Km在1.1~6mmol之间，,亚基的分子量在4.2#215;104~5.4#215;104之间。蒜氨酸酶的最适温度为30 ℃，在25~45 ℃的温度范围内比较稳定；最适pH值为6.5，在5.0~7.6的pH范围内比较稳定 [20]。

蒜氨酸酶的抑制剂包括羟胺硫酸盐、鱼藤酮、氨基氧乙酸、氨基氧丙酸、环丝氨酸、半胱氨酸及大多数非氧化形式的衍生物，其中羟胺硫酸盐和鱼藤酮的抑制作用较强。K 、Na 、Cd2 、Ca2 、Mg2 、Zn2 、Fe2 、Fe3 、EDTA-Na等金属离子皆不同程度地提高蒜氨酸酶的活性，其中以Fe2 、Fe3 效果最为明显，而Cu2 严重抑制蒜氨酸酶活性[20, 21]。

1.4.3 与大蒜绿变的关系

蒜氨酸酶可催化S-烷基-L-半胱氨酸亚砜类反应，但不能催化硫醚的类似物及 L-蛋氨酸亚砜的反应[20]。蒜泥绿色素的形成过程中，蒜氨酸酶参与了反应[22]。蒜氨酸酶对大蒜绿变起着催化作用，大蒜细胞中的生物活性物质硫代脂肪族半胱氨酸亚砜和硫代丙烯基半胱氨酸亚砜等含硫化合物在蒜酶的作用下，生成硫代亚磺酸酯、丙烯基硫代亚磺酸酯、烯丙基硫代亚磺酸酯，作为大蒜色素物质的前体，进一步发生大蒜绿变。蒜氨酸酶与大蒜绿变有直接的关系，参与了反应；蒜氨酸酶只是大蒜发生绿变的必要条件之一，但不是唯一条件。

1.5 研究目的与意义

目的：（1）通过低温（4℃）萌发，研究γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶、大蒜绿变指数的变化，观察其具体数据的变化曲线，探明两种酶与大蒜绿变的关系。（2）采用低温萌发-浸泡，研究浸泡对γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶、大蒜绿变指数的影响，分析在浸泡条件下大蒜绿变与酶的关系。

意义：大蒜在加工过程中经常发生绿变，在视觉上往往达不到美观的要求，因而减少了其商业价值，对于大蒜加工工业的长远发展不利。本论文研究处于不同生理期的大蒜，对探究抑制大蒜绿变的途径、大蒜规模化加工生产具有重要意义。

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文 献 综 述

1.1 前言

大蒜（Allium Sativum L.）为百合科葱属植物蒜的鳞茎，二年生植物。其营养价值很高，含有蛋白质、糖类、脂肪和维生素、钙、磷、铁、硒、锗等矿质元素[1,2]（表1，表2），还含有多糖、凝集素[3,4]和一些酶类（如蒜氨酸酶、过氧化物酶、γ-谷氨酰转肽酶等）[5,6]。大蒜中主要的生物活性物质是大蒜所特有的含硫化合物，这些含硫化合物赋予了大蒜很高的药用价值，如抗癌防癌、降血压、降胆固醇、抗氧化、抗肿瘤、抗血小板聚集、降血脂和抗动脉粥样硬化、保护心血管、降低血糖等作用[5]。大蒜的休眠期短，易发芽霉变和品质劣变，长期贮藏损耗率较高[7]。大蒜除鲜食外，常加工成蒜片、蒜粉、黑大蒜、蒜泥等。但是大蒜制品在加工过程往往中会出现绿变的现象，这一定程度上影响了产品的外观质量，妨碍了大蒜进行二步加工。而大蒜绿变与其生理休眠状态有关，处于休眠的大蒜，其蒜泥不会发生变绿现象，结束休眠大蒜的蒜泥会变绿[8,9,10]。因此，研究处于不同生理期的大蒜，对探究抑制大蒜绿变的途径、大蒜规模化加工生产具有重要意义。

表1 新鲜大蒜鳞茎中主要成分的含量（g/100g-WM）

Table 1 The content of main components in fresh garlic