文 献 综 述

1. 概述

谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, EC4. 1. 1. 15,简称GAD)是磷酸吡哆醛(pyridoxal 5#8217;-phosphate, PLP)依赖型酶,催化谷氨酸(glutamic acid, Glu)脱羧生成γ-氨基丁酸 (aminobutyric acid, GABA)[1]。GABA作为一种非蛋白的功能性氨基酸，是动物中枢神经系统中重要的神经递质，具有重要的生理功能，例如增强肝、肾功能；防止高血压、动脉硬化和心律失常；消除睡眠障碍等[2]。在GABA生产中，GAD起到了关键性作用，它作为一种不稳定的游离酶，其内在氨基酸结构或者外界化学微环境的变化都会导致酶活下降甚至失活[3]。酶的固定化技术可使游离酶的稳定性差、难回收等问题得到解决[4]。本研究旨在用合适的食品级的材料对GAD进行固定化，应用于GABA生产。

2. 植物GAD结构

在酶的固定化过程中也可能导致酶的构相或理化性质改变而影响酶的活性[4]。为了最大限度减小固定化后的酶活损失，首先需要对GAD的结构和活性中心特点进行了解，并在此基础上选择合适的固定化方法。

GAD(拟南芥)的空间结构如图1所示[5]。GAD为同源六聚体，该六聚体由双层的三个子聚体构成。图中六个亚基分别用不同的颜色描绘。

图1 拟南芥GAD的空间结构

一般而言，许多氨基酸残基上的基团都对酶的活性有十分重要的作用，如Cys、Lys、His、Arg。赖氨酸的突变会导致磷酸吡哆醛(PLP)的亲和力大大降低而影响酶的活性[6]。原因为赖氨酸是PLP的主要结合位点，其R基侧链上的伯氨基与PLP形成Schiff键来维持PLP的亲和力[7]。用化学试剂分别对Trp、His、Arg、Met残基的侧链及羟基、羧基、二硫键等基团进行化学修饰，结果表明His和Arg被修饰后酶的失活率分别达到40%和100%，其他基团被修饰后失活率较低[1]。失活的原因为His的咪唑基和Arg的胍基为带正电荷的基团，因此His和Arg可能是为PLP提供正电荷的氨基酸残基[7]。

以上述GAD的结构及活性的关系为基础，可以为酶固定化方法的选择提供依据。在对酶进行共价修饰时，需保证上述重要的活性氨基酸不失活，同时要尽量维持GAD的原来空间结构，减少空间位阻。

3. GAD固定方法及研究进展