文 献 综 述

1.1 研究目的及意义

本实验主要研究蔗糖异构酶在枯草芽孢杆菌中的构建表达。实验将为构建食品级的安全宿主提供重要理论和实验数据，对异麦芽酮糖的工业化生产具有重要应用价值。

蔗糖异构酶（sucrose isomerase，SIase）是催化蔗糖异构为异麦芽酮糖（6-O-α-D-吡喃葡糖基-D- 果糖，isomaltulose）和海藻酮糖（1-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，trehalulose）的关键酶。异麦芽酮糖是一类还原糖，在天然蜂蜜中少量存在，具有与蔗糖类似的物理性质和口感[1]，此外还具有一些蔗糖无以伦比的优良特性，如甜度低，异麦芽酮糖的甜度仅为蔗糖的52%[2]，非致龋齿性，被人体食用后在血液中释放单糖的速度缓慢且不刺激胰岛素分泌，因而有益于糖尿病的防治并可防止脂肪的过多积累[3-4]。异麦芽酮糖还拥有极低的吸湿性，所以相应产品的货架期也更长[5]。

枯草芽孢杆菌是一类好氧型，内生抗逆孢子的杆状细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物的体表，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，能直接将许多蛋白分泌到培养基中。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景[6]。枯草芽孢杆菌是经美国FDA 认证的安全菌株，其发酵产物可直接用于食品生产中。具有可操作性强、发酵周期短的特点，避免了大肠杆菌表达系统复杂的分离纯化步骤，同时提高了安全性[7]。总体来说，枯草杆菌作为工业中应用较广泛的分泌表达宿主，与其他革兰氏阳性菌相比，在某些方面具有明显的优势：第一，枯草杆菌属于公认的食品工业安全菌；第二，枯草杆菌具有强大的蛋白分泌能力；第三，无明显密码子偏好性；第四，有关转录、翻译、蛋白折叠和分泌机理已被广泛研究[8] 。

构建高效的基因工程产酶菌株已成为异麦芽酮糖研究的主流趋势，但是异麦芽酮糖作为一种功能性食品添加剂，用大肠杆菌作为宿主菌存在着安全隐患，因此构建食品级的基因工程菌将成为异麦芽酮糖研究的热点问题。

1.2 研究现状

1.2.1 SIase的研究概况

1984年，Cheetham在Nature杂志上首次发表用Erwinia rhapontici细胞转化蔗糖生产异麦芽酮糖，并从中分离得到较纯的SIase（4.11 U/mg），第一个提出异麦芽酮糖的合成与SIase有关，该酶不需要任何辅酶并对蔗糖具有严格的底物特异性[9]。

SIase均来源于常温微生物，其最适反应温度一般在20~40 #176;C之间。反应温度是生物催化蔗糖异构化反应中一个非常重要的参数，蔗糖异构化的产物比例受温度影响较大，但不会改变糖的最终生成量。低温有利于海藻酮糖的生成，而较高的反应温度适合于异麦芽酮糖的生成，如P. mesoacidophila MX-45的最适温度为20 #176;C[10]，而K. sp. LX-3 和Erwinia sp. D12的最适温度分别为35 #176;C，30 #176;C[11-12]。反应温度越高，反应速度就越快，但高温条件（50 #176;C以上）加剧蔗糖的水解反应，葡萄糖和果糖的生成量增多[13]。