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摘 要

第一章 文献综述 6

1.1PHB的基本性质 6

1.2PHB的应用 6

1.2.1医药行业的应用 6

1.2.2工业上的应用 7

1.2.3农业上的应用 7

1.3.微生物合成PHB的研究进展 7

1.4纤维床生物反应器（FBB） 7

1.5利用大肠杆菌生产重组蛋白 8

第二章 材料与方法 10

2.1实验材料 10

2.1.1菌种 10

2.1.2仪器与试剂 10

2.2.1废糖蜜 11

2.2.2培养基pH测定 11

2.2.3细胞密度的测定 11

2.2.4碳源浓度的测定 11

2.2.5废糖蜜预处理 12

2.2.6生长曲线的测定 13

2.2.7罐上固定化发酵实验 13

第三章 结果与讨论 16

3.1 甘蔗废糖蜜的稀释处理 16

3.2. 不同碳源对固定化批次发酵PHB的影响 17

3.3. 不同pH值对固定化批次发酵废糖蜜的影响 18

3.4. 不同原料预处理方法对固定化批次发酵废糖蜜的影响 21

3.5.固定化补料流加发酵预处理废糖蜜生产PHB的研究 23

第四章 结论与展望 25

4.1结论 25

4.1.1发酵动力学研究 25

4.1.1.1不同碳源对固定化批次发酵PHB的影响 25

4.1.1.2甘蔗废糖蜜的稀释处理 25

4.1.1.3不同pH值对固定化批次发酵废糖蜜的影响 26

4.1.2纤维床生物反应器 26

4.2展望 26

4.2.1遗传改造转基因大肠杆菌(E．coli)高产PHB技术 26

4.2.2纤维床反应器放大技术 27

参考文献 28

致谢 30

摘要

PHB即聚羟基脂肪酸脂是一种微生物体内的脂类累积物，也可以作为一种碳源和能源的储备物。它可以在微生物的细胞内大量累积而不影响细胞内外的渗透压，所以在高产量方面有着相当光明的前景。而且PHB在医学、农业和工业等多个领域都有应用，其作为一种生物可降解材料生产绿色环保的生物塑料更是这几年世界性的最热门研究之一。

本实验利用转基因大肠杆菌(E．coli)以廉价的工业废糖蜜作为碳源生产PHB为主体，从多个角度考虑优化实验方法。本课题以提高PHB的产量为目的，同时研究转基因大肠杆菌对碳源的利用情况、pH、原料浓度、原料预处理、发酵动力学和FBB固定化发酵等多种条件的最优方案。最终，采用固定化补料流加发酵预处理废糖蜜底物时，PHB的产量达到44.3g/L，与批次发酵相比，提高了80.08%。

关键词：PHB，转基因大肠杆菌，废糖蜜，固定化发酵。

Abstract

PHB，polyhydroxybutyrate，is a kind of lipids accumulation which stores in some kinds of microorganisms. It also plays the role of carbon and energy source which is reserved, which can be in the microbial penetration in the intracellular accumulation without affecting cell internal and external pressure. So there is a bright future in the highly producing yield. PHB is used in the fields of medicine, agriculture and industry. Moreover, it is one of the most popular research as a kind of biodegradable material for the production of friendly environmental protection of bio-plastics these years in the whole world.

Escherichia coli was enployed in this study to produce PHB as the main production with cheap industrial waste molasses as the carbon source, considering the optimization of experimental methods discussing variously. This experiment aimed at how to improve amount of producing PHB. At the same time, the optimal case under various conditions was studied, including the situation of Escherichia coli using carbon resource, pH, concentration of the raw material, the pretreatment of raw materials, the FBB fermentation kinetics and the immobilized fermentation. At last, the concentrate of PHB reached up to 44.3g/L with waste molasse as the substrate in fed-batch FBB fermentation, increased by 80.08% compared with the batch FBB fermentation.

Keywords: PHB, Escherichia coli, waste molasse, fermentation kinetics.

文献综述

1.1PHB的基本性质

PHB是在细菌体内的一种累积物，也是酯类的聚合物，它主要是被用作提供碳源和能源的储备物。并且由于具有较低的溶解性和相对高的摩尔质量，所以PHB可以在细菌胞内大量储存而不会影响胞内外的渗透压， 也是一种理想的储存材料。当人为地增加碳氮比后，细菌体内的PHB含量就会有所上升。例如，当细菌的碳源充足而镁离子、硫酸根离子、磷酸根离子或者氮氧元素不足时，PHB会被迅速地合成；而当细胞生长需要用到碳源与能源时，可将所累积的脂质颗粒分解利用^[1]。PHB的结构式如下图所示：

PHB具有良好的生物可降解性^[2]，其分解产物甚至可以全部为生物所利用，对环境则无任何污染；其熔融温度在175～180℃，同时也是一种可完全分解的热塑性塑料^[3]。与传统的化学合成的高分子材料相比，PHB作为一种由微生物合成的生物塑料，不仅具有化学合成的高分子塑料的特性，而且还有如下特点：密度大、抗凝血性、生物可降解性、透氧性低、抗紫外线辐射、压电性、生物组织相容性和光学活性好等，可在生物医学、光学、电子等高技术领域获得应用。

1.2PHB的应用

1.2.1医药行业的应用

作为应用在组织工程中的基质材料必须要具有以下性能：A）良好的生物相容性^[4];B)细胞在材料表面能良好地粘附和增殖^[5];C)细胞能够被诱导按材料预制形态生长;D)在新组织生长成熟后,材料能够在体内降解成对人体无毒害的小分子,并通过人体代谢排出体外^[6].此外PHB具有生物可降解性、无毒性、生物相容性、无刺激性、光学活性、无免疫原性、压电性等人工化学合成高分子材料所没有的性质,因此PHB在皮肤组织工程、软骨组织工程、心脏瓣膜组织工程、骨组织工程、神经系统组织工程和血管组织工程等医学工程中具有相当广阔的应用前景^[7].

1.2.2工业上的应用

由于PHB具有压电性,可制成振荡发生器、点火器、声学仪器、制造压力传感器和压电制品等,还可用作换能元件,尤其是用作生物体内的换能器。

1.2.3农业上的应用

PHB可制成除草剂、杀虫剂、化学肥料的缓释载体，缓慢地将农药释放到土壤中，变相地保持了农药的长久性。可以用于制作农用地膜，可抑制杂草生长，提高土壤温度，对农作物的绿色增产具有重要意义。使用可降解材料制成的农用地膜，可大大减少对环境和土壤的污染。

1.3.微生物合成PHB的研究进展

产生颗粒PHB或PHB类似物的原核生物既有革兰氏阳性菌也有革兰氏阴性菌，例如：巨大芽孢杆菌(B．megaterium)、肥大产碱杆菌(A．1atus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophi—CUS)、拜 氏 固 氮 菌(A．beijerinckii)、真养产碱杆菌(A．eutrophus)、棕色固氮菌(Azotobacter vine1andii)^[8]、 球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、极端嗜盐菌(Halof erax mediterranei)以及恶臭假单胞菌(P．putida)、豚鼠气单胞菌(Aeromanas caviae)、扭脱原单胞菌(Protomonas ec．torguens)、红色红球菌(Rhodococcus tuber)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comomomas testosteroln)等等^[9]，其中真养产碱杆菌(A．eutrophus)是目前研究最多的生产PHB菌种。随着在PHB研发中的基因工程方面的技术应用，转基因大肠杆菌(E．coli)将成为生产PHB的重要相关工程菌种^[10-11]。

1.4纤维床生物反应器（FBB）

纤维床生物反应器（FBB）是由美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人在改进传统的填充床反应器（packed bed reactor，PBR）一些性能的基础上设计出的一种简单而又高效的生物反应器，并首先应用于丙酸的发酵^[12]。FBB选择棉质纤维织物等纤维材料作为细胞的固定载体，具有以下几种优点^[13-15]：①材料化学惰性，对发酵细胞无毒害作用，也不会被细胞侵蚀、降解，且不影响微生物的生长代谢；②具有较高的孔隙率（gt;95%）和比表面积（gt;40 m²/m³），因此具有良好的传质性能；③其固定化细胞的活性回收率高，即具有较高的载体活性；④单位体积固定的细胞数较多（细胞密度最高可达70 g/L）；⑤材料较易获得，价格便宜，固定化成本低；⑥制备方法简单易操作，固定化过程温和，也可适用于大规模生产；⑦有较高的机械强度（不锈钢丝若加以支撑能进一步强化其机械强度），能使用较长时间；⑧生物、化学及热力学性质稳定，因此成为一种理想的细胞固定载体。与其它类型的固定化反应器相比，以纤维材料为吸附载体的FBB具有许多优点，包括操作稳定性好、高传质效率、制作简便、低压降、产物收率高、工作周期长、底物耐受性高、易于工业放大、可耐轻度污染以及成本低廉等。

1.5利用大肠杆菌生产重组蛋白

重组蛋白在医疗诊断、科研领域以及与人类健康休戚相关的工业化生产的产品等多个领域中有着举足轻重地位。大规模培养技术和重组DNA技术有力地支撑和推动了重组蛋白产业的生产产业^[16]。因为大肠杆菌(E. coli)具有很多可行的基因表达系统所以被广泛地应用于生产重组蛋白的实践中。然而利用大肠杆菌生产重组蛋白也同时存在一些问题。比如,大肠杆菌不适用于生产含有二硫键、分子量大和需要翻译后修饰的复杂蛋白。此外,由于蛋白酶的降解作用，被大肠杆菌所生产的外源性蛋白的稳定性会有所降低。同时,过量表达的蛋白质经常会转化为包涵体,而要使这些包涵体恢复相应的生化功能,就必须经过复杂而昂贵的重新折叠和变性的过程。为了针对这些问题,各种相关生物技术应运而生。比如,选用不同的宿主菌株和启动子、共表达伴侣蛋白以及调整培养时的物理因素等。研究者们还开发了很多种方法,使重组蛋白可以定向地表达在细胞的不同位置中^[17]。归纳用于生产重组蛋白在E.coli中的各种策略^[16]，如图1所示。

图1. E.coli中用于生产重组蛋白的各种策略

第二章 材料与方法

本章节实验主要探究以葡萄糖、蔗糖和果糖为碳源，采用的是固定化补料流加发酵模式合成PHB的动力学特征。

2.1实验材料

2.1.1菌种

转基因大肠杆菌(E．coli)，由实验室保藏提供。

2.1.2仪器与试剂

立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；YQX-II厌氧培养箱（上海跃进医疗器械厂）；DRP-9052型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；Hitachi F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司）；AL104电子天平（Mettler Toledo）；MP120-BLE便携式酸度计（Mettler Toledo）；紫外/可见分光光度计（Amershan Biosciences）；MODEL ECLIPSE E400显微镜（Nikon）。

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