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摘 要

海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖合成酶是海藻糖最简单合成途径中的关键酶。本文开发了利用大肠杆菌高密度发酵生产海藻糖合成酶的工艺，通过调控发酵的培养基、pH、诱导时机等条件的优化，确定摇发酵的最优条件；再以pH-stat补料发酵方式培养重组大肠杆菌，得到5L 发酵罐上的海藻糖合成酶的产酶条件参数。重组大肠杆菌在pH-stat法发酵时，在发酵进行20 h后OD值可达44，酶活高达12300u/ml，单位体积内海藻糖合成酶表达量可达到分批发酵的4.5倍。

关键词：海藻糖 海藻糖合成酶 pH-stat发酵 大肠杆菌

Abstract

Trehalose has a protective effect on organisms, keeping organisms away from permeation pressure and drying the harsh conditions of high temperature, forming a unique protective film in cell surface to protect the protein molecular deactivation. Trehalose synthase is the key enzyme of in the synthesis route of producing trehalose. This paper discusses the use of the high density fermentation of Escherichia coli to produce trehalose synthase. Optimization of screening medium, fermentive pH control, induction time and other conditions were completed to determine the optimal conditions of fermentation in shake flask. Then the pH-stat fed batch fermentation method was used to obtain the optimal conditions of fermentation in 5 Lfermentor , in which the OD of the E. coli could reach upto 44 after fermentation for 20 h, with the enzyme activity 12300 and the amount of trehalose synthase expression reaching 4.5 times batch fermentation.

Keywords:Trehalose; Trehalose synthase; pH-stat fermentation; Escherichia coli

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1简介 1

1.2制备的方法与应用 1

1.2.1制备方法 1

1.2.2海藻糖的应用 5

1.3海藻糖合成酶的理化性质 9

1.4重组大肠杆菌补料发酵pH-stat补料 9

1.5实验思路 10

第二章 实验材料试验方法 11

2.1实验材料 11

2.1.1 菌种 11

2.1.2 培养基 11

2.2 实验方法 13

2.2.1 种子培养 13

2.2.2 摇瓶分批式发酵 13

2.2.3 pH-stat补料分批发酵 13

2.2.4 粗酶液制备 14

2.2.5 酶法破壁试验 14

2.2.6 酶活力测定 14

第三章 结果与讨论 15

3.1培养基对工程菌以及酶的影响 15

3.2 pH对工程菌生长影响情况 16

3.3 诱导时机对工程菌产酶影响 16

3.4 pH-stat分批发酵生产海藻糖合成酶 17

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

1.1简介

海藻糖”这个术语源于一种沙漠甘露-虫茧蜜，它是由法国化学家Berthelot 发现的(Nwaka amp; Holzer,1998)^[1,2]。海藻糖是由两个吡喃环葡萄糖分子通过半缩醛羟基以 α-1，1 糖苷键缩合而成的非还原性双糖。它的分子式为 C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O ，相对分子量为 378.33天然海藻糖在常温下是白色结晶，易溶于水、热乙醇，不溶于乙醚、丙酮，无毒无害，无过敏性，具有甜味，在体内可被降解成葡萄糖而被利用。

1.2制备的方法与应用

1.2.1制备方法

1.2.1.1微生物抽提法

最早生产海藻糖的方法是从面包酵母、啤酒酵母中提取^[1]，这也是目前制备海藻糖的主要方法^[2]。海藻糖是酵母营养细胞和孢子的一种重要贮存的碳水化合物，对调节和保护细胞在极端条件下的活力有重要作用。多种生长因素，如营养饥饿、提高温度、干燥或冷冻等都会使细胞海藻糖含量显著增高。酵母中海藻糖的合成依赖于两种酶，海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸酯酶，这两个酶只能以高能量的化合物 6-磷酸-葡萄糖和 UDP-葡萄糖为底物，因此产率不高。

这种方法首先通过诱变、细胞融合或基因重组选育海藻糖含量高的菌株，然后采用高浓度的培养基及高渗透压换环境进行发酵，并在发酵结束前让酵母菌“饥饿”2~3 小时才送入碳源(这就是苏联爱尔坎——沙哈斯流程)。富集酵母细胞，先用酒精浸提，然后加入乙酸铅去除蛋白质，再用硫化氢除过量的铅，浸提液用活性炭脱色，蒸法浓缩结晶析出海藻糖晶体。自从1950年Laura 首次从各种酵母中制备出海藻糖，并证明了活性干酵母中海藻糖含量较高之后，Lillie 等报道了采用三氯乙酸提取海藻糖；1991 年，Yumi-yoshikawa 等报道了用温度为 73℃以上、浓度为45%~50%乙醇水溶液可得到较高提取率；1995年山崎彬等^[3]

采用高压处理酵母以提高抽提率；我国已将这种方法列为“九五攻关计划”，葛文光等^[3]对提取工艺进行了改进，取得了较好的效果；中科院微生物所 714 课题组采用此法，每吨发酵液可得 3~4 公斤海藻糖；中科院微生物所708课题组“利用废弃酵母生产海藻糖”经过专家鉴定，于1999年开始推向市场，但这种方法制造成本过高，价格昂贵限制了这一方法的工业应用。

除酵母菌外，大肠杆菌、链霉菌、乳酸菌、微球菌和真菌等，也有海藻糖的积累现象^[4]。据报道记载的真菌有20几个属33个种等均可以作为开发海藻糖的菌种资源。

1.2.1.2 微生物发酵法

微生物发酵法是在一定的基质上培养微生物，通过微生物发酵代谢生产海藻

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