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摘 要

羰基还原酶(EC 1.1.1.184)是一种以NADPH或NADH为辅酶，催化羰基的不对称还原、产生光学活性醇的短链脱氢/还原酶^[1]。光学活性醇是转化手性药物的重要中间体，是目前生物催化或生物转化研究的一种重要目的产物^[2]。并且羰基还原酶在催化不对称还原时具有效率高、反应条件温和、反应选择性好、污染小等优点 ^[3]，在本研究中，利用PCR技术成功地扩增了来自海洋新鞘氨醇杆菌（novospingobium sp.)中的羰基还原酶基因（CBRS），并构建了诱导型表达载体pET28a-CBRS(包含amp基因），导入宿主E. coli BL21(DE3)后获得了表达羰基还原酶基因的重组菌BL21(DE3)/pET28a-CBRS(包含amp基因)。重组菌的培养条件，本实验选定为：37℃，220rpm的摇床培养，在OD600为0.6-0.8时加入诱导剂，诱导剂的终浓度为1.0 mmol/L，诱导培养13h后测酶活，以苯乙酮为底物，依赖于辅酶NADH，测得酶活为1965u/L。

关键词：羰基还原酶 重组大肠杆菌 表达载体 苯乙酮

Construction of carbonyl reductase engineering bacteria E. coli

Abstract

Carbonyl reductase (EC 1.1.1.184) is a kind of NADH or NADPH coenzyme asymmetric catalytic reduction of carbonyl groups to produce optically active alcohols short chain dehydrogenase / reductase,Optically active alcohol is an important intermediate in the synthesis of chiral drugs ^[1], is an important target product Biocatalysis and biotransformation studies. And carbonyl reductase with high efficiency^[2], mild reaction conditions, the reaction selectivity, little pollution, etc^[3]. Carbonyl reductase has significant value in the synthesis of chiral pharmaceutical intermediates, In the present study, the use of PCR technology was successfully amplified from novospingobium sp. In the carbonyl reductase gene (CBRS), And construct an inducible expression vector pET28a-CBRS (containing the amp gene), introduced into a host E. coli BL21 (DE3) recombinant strain obtained after the expression of the carbonyl reductase gene in BL21 (DE3) / pET28a-CBRS (containing the amp gene). Recombinant bacteria culture conditions, this experiment selected as: 37 ℃, 220rpm shaking culture,In OD600 0.6-0.8 joining inducer inducer final concentration of 1.0 mmol / L, inducing activity measured after 13h culture, acetophenone as substrate, depending on the coenzyme NADH, measured activity was 1965u / L.

Keywords : Carbonyl reductase Recombinant E. Coli Expression vectors Acetophenone

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1羰基还原酶 1

1.1.1羰基还原酶的研究进展 1

1.1.2 羰基还原酶的应用 1

1.1.3微生物中的羰基还原酶 2

1.1.4代谢途径中的羰基还原酶 2

1.2手性醇的理化性质和应用 2

1.2.1手性醇简介 3

1.2.2手性醇的合成方法 3

1.3 利用基因工程技术构建大肠杆菌工程菌 3

第二章 实验材料 4

2.1 实验仪器 4

2.2 实验药品 5

第三章 实验方法 7

3.1 质粒与菌株 7

3.2 培养基 7

3.2.1 培养基配方 7

3.3 实验方法 7

3.3.1 引物设计 7

3.3.2 聚合酶链式反应（PCR） 8

3.3.3 琼脂糖凝胶电泳 9

3.3.4 质粒DNA的提取与测序 9

3.3.5 大肠杆菌BL21感受态细胞的制备方法 9

3.3.6 外源DNA与载体的连接 10

3.3.7 热休克转化方法 10

3.3.8 羰基还原酶酶活的测定 10

第四章 实验结果与讨论 11

4.1 CBRS基因的PCR扩增结果及与T-Vector连接结果 11

4.2 表达载体pET-CBRS的构建 12

4.2.1 重组质粒pET28a-CBRS的构建结果 13

4.2.2 表达载体pET28a-CBRS的构建结果的验证 13

4.2.3 菌落PCR的验证结果 14

4.3 羰基还原酶酶活的测定结果 15

第五章 结论与展望 16

参考文献 17

致 谢 20

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