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摘 要

前期研究中发现ε-聚赖氨酸生产菌株Streptomyces albulus PD-1可分泌一种新型非蛋白质氨基酸均聚物—β-聚二氨基丙酸（PDAP）。本研究通过S. albulus PD-1基因组预测、假定基因敲除和异源表达以及体外单体喂养实验确定了PDAP合成酶的基因序列和蛋白序列。然后通过生物信息学分析发现PDAP合成酶是一种非常规的非核糖体肽合成酶，并且此酶在结构上与ε-聚赖氨酸合成酶呈现出高度的相似性。我们猜测此种非核糖体肽合成酶结构可能是此类阳离子聚氨基酸合成酶的共有特征，为今后发现或者设计更多的聚氨基酸提供了理论依据和参考价值。

关键词：Streptomyces albulus PD-1，β-聚二氨基丙酸，基因组挖掘，非核糖体肽合成酶

Abstract

Previous studies found Streptomyces albulus PD-1, a famous ε-polylysine-producing strain, could secrete poly(β-L-diaminopropionic acid) (PDAP), a novel homopoly(amino acid)s, with ε-polylysine. In this study, we determined the gene sequence and protein sequence of PDAP synthetase in S. albulus PD-1 by gene prediction, putative-gene knockout, heterologous expression and monomer feeding experiments. As a result, we found PDAP synthetase is an unusual non-ribosomal peptide synthetase, and it exhibits a high degree of similarity in structure compared with ε-polylysine synthetase. It is speculated that this novel non-ribosomal peptide synthetase is the common character of synthetase of the cationic homopoly(amino acid)s, and provide a theoretical basis and reference value for the future design or find more homopoly(amino acid)s.

Keyword: Streptomyces albulus PD-1; Poly(L-diaminopropionicacid); Genome mining; Non-ribosomal peptide synthetase

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 聚氨基酸简介 1

1.2.1 聚氨基酸的结构与性质 1

1.2.2 ε-聚赖氨酸介绍 3

1.2.3 β-聚二氨基丙酸介绍 4

1.3 非核糖体肽合成酶 4

1.4 论文的意义及内容 5

第二章 实验材料与方法 7

2.1 主要实验仪器 7

2.2 主要实验试剂 7

2.3 菌株、质粒、引物 8

2.4 培养基 9

2.5 假定β-聚二氨基丙酸合成酶的基因失活 9

2.5.1 敲除质粒的构建 9

2.5.2 PDAPs基因失活菌株的构建和筛选 10

2.6 假定β-聚二氨基丙酸合成酶的异源表达与产物鉴定 10

2.7 β-聚二氨基丙酸合成酶A-domain底物特异性分析 10

2.7.1 PDAP A-domain表达载体的构建 10

2.7.2 PDAP A-domain诱导表达 11

2.7.3 PDAPs A-domain对各种氨基酸底物的催化能力测定 11

第三章 实验结果与讨论 12

3.1 β-聚二氨基丙酸合成酶的基因预测 12

3.2 假定β-聚二氨基丙酸合成酶基因敲除 13

3.3 假定β-聚二氨基丙酸合成酶的异源表达 15

3.4 β-聚二氨基丙酸合成酶A-domain催化底物特异性研究 16

3.5 β-聚二氨基丙酸合成酶关键结构域解析 17

3.6 β-聚二氨基丙酸合成酶催化机制预测 20

3.7 本章小结 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论： 22

4.2 展望： 22

参考文献 24

致 谢 26

第一章 文献综述

1.1 前言

聚氨基酸是由同种氨基酸单体通过酰胺键连接而成的线性同聚物。这些高聚物侧链上含有大量羧基或氨基基团，因此它们易于修饰与功能化，并被赋予了一些特殊的生理功能。由其独特的结构呈现出良好的水溶性，粘合性，成膜性、成胶性、螯合性、分散性、絮凝性等特性，因此在医药，食品，化工方面有大量的应用。例如聚天冬氨酸具有无磷、无毒、无公害和可完全生物降解的特性，对离子有极强的螯合能力，具有缓蚀和阻垢的效果，是一种新型的绿色水处理剂。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）则表现出很好的保水性，能够促进植物对营养物质的吸收，同时提高植物的耐盐，耐旱，耐寒的能力。ε-聚赖氨酸（ε-PL）由于具有抑菌谱广、抑菌性强、安全性好、稳定性强等优良特性，作为天然食品防腐剂广泛地应用于美国，日本等国家，2014年中国也批准使用该防腐剂。这些聚氨基酸在食品防腐剂，食品增稠剂，化肥增效剂等多个领域具有广阔的前景。这些聚氨基酸中有些是由化学方法制备，有些利用微生物发酵制备，而其中微生物来源为主要方向。

目前已有4种微生物源聚氨基酸被发现，这与已发现500多种氨基酸单体的今天相比可以说是相当的少^[1-3]，究其原因我们猜测是缺少一种将氨基酸单体不断进行组装的生物原件，我们将其称之为聚氨基酸合成酶，目前只有γ-PGA和ε-PL的合成酶被发现^[3]。因此，聚氨基酸合成酶的研究将会大大推动微生物源聚氨基酸的发展，在之前的研究中我们从ε-PL高产菌株Streptomyces albulus PD-1中发现了自然界第四种聚氨基酸—β-聚二氨基丙酸(PDAP)，但是对于PDAP合成酶的了解还不够，所以对PDAP合成酶及其生物组装机制的研究将大大扩展人们对天然聚氨基酸生物合成机制的的了解，并为将来发掘和人工设计更多的聚氨基酸提供良好的理论依据。另外，一株微生物能够分泌两种天然聚氨基酸实属罕见，能否实现此两种聚氨基酸的高效生具有重要的现实意义，同时也为类似生物高分子的基础研究与应用实践提供了有益借鉴。

1.2 聚氨基酸简介

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