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摘 要

酸性磷酸酯酶（acid phosphatase，简称ACPase，国际酶学委员会编号为E.C. 3.1.3.2）是一组能够在酸性条件下催化磷酸单酯键的水解反应，生成磷酸和相应脂肪酸的一类疏基酶，在生物体内有机磷代谢和调节的过程中起着不可或缺的重要作用。为达到将ACPase进行高产量、低成本、优品质的商品化生产的目的，本研究利用DNA重组技术，构建了一株可表达酸性磷酸酯酶的基因构建菌。研究通过测定底物（对硝基苯磷酸二钠，简称pNPP）不同浓度下酸性磷酸酯酶的酶活力，以及温度、pH值和不同的金属离子对该酸性磷酸酯酶酶活力的影响，对该菌构建质粒表达产生的ACPase进行了酶学性质的初步研究，得到该酶的米氏常数（K_m）、最适温度、最适pH值及稳定性数据；使用5 L全自动微生物发酵罐培养获得不同碳源、氮源及碳氮比对构建菌生长的影响数据。以上研究及数据为构建菌后期进行的中试发酵与工业放大提供了重要可靠的参考数据。

关键词：酸性磷酸酯酶 基因构建菌 酶活 发酵罐

Preliminary Study on the Culture Condition of an Acid Phosphatase Construction Bacteria

ABSTRACT

Acid phosphatase (ACPase, It was numbered as E.C. 3.1.3.2 by International Commission on Enzymes) is a group of enzymes capable of catalyzing the hydrolysis reaction of phosphoric acid monoester under acidic conditions, producing a class of phytase of phosphoric acid and corresponding fatty acids. It plays an indispensable role in the process of organophosphate metabolism and regulation in the organism. In order to achieve the purpose of commercial production of ACPase with high yield, low cost and excellent quality, a construction strain producing acid phosphate esterase constructed by DNA recombination technique was researched in this paper. In this research, the preliminary study on enzymatic properties of ACPase produced by this strain was carried out. The Michaelis-Menten constant (K_m) of this enzyme was obtained by measuring the enzymatic activity of acid phosphatase at different substrate concentrations (disodium p-nitrophenylphosphate, referred to as pNPP). The effects of temperature, pH value and different metal ions on the activity of acid phosphatase were investigated by experiments, and the optimum temperature, optimum pH value and stability data were obtained. 5 L automatic microbial fermentor was used to obtain the data of different carbon sources, nitrogen sources and C / N ratios effection on the growth of constructed strain. In summary, the data obtained in this research could provide important and reliable reference data for the pilot fermentation and industrial amplification.

Key words: acid phosphatase; genetically engineered bacteria; enzyme activity; fermenter.

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 酸性磷酸酯酶 1

1.1.1 酸性磷酸酯酶概述 1

1.1.2 酸性磷酸酯酶的应用领域 1

1.2 酸性磷酸酯酶活性的测定方法 3

1.3 酸性磷酸酯酶基因工程菌的发酵 3

1.3.1基因工程菌及高密度发酵技术 3

1.3.2 高密度发酵的影响条件 4

1.4 本课题的研究内容及意义 5

第二章 酶学性质研究 6

2.1实验材料 6

2.2实验方法 6

2.2.1 ACPase米氏常数（K_m）的测定 6

2.2.2 不同金属离子对ACPase活力的影响探究 7

2.2.3 不同温度对ACPase活力的影响探究 7

2.2.4 不同pH对ACPase活力的影响探究 7

2.3 结果与讨论 8

2.3.1 酸性磷酸酯酶的米氏常数（K_m） 8

2.3.2 不同金属离子对ACPase活力的影响 8

2.3.3 不同温度对ACPase活力的影响 9

2.3.4 不同pH对ACPase活力的影响 10

第三章 发酵条件优化 12

3.1实验材料 12

3.2实验方法 13

3.2.1主要溶液成分与培养基 13

3.2.2 发酵种子液的制备 14

3.2.3电极标定 14

3.2.4 实罐灭菌 15

3.2.5 发酵操作 16

3.3 结果与讨论 20

3.3.1 碳源条件优化结果 20

3.3.2 氮源优化结果 22

3.3.3 碳氮比优化结果 24

第四章 结论与展望 26

4.1 结论 26

4.2 展望 26

参考文献 27

致 谢 30

第一章 文献综述

1.1 酸性磷酸酯酶

1.1.1 酸性磷酸酯酶概述

酸性磷酸酯酶（acid phosphatase，简称ACPase，国际酶学委员会编号为E.C 3.1.3.2）是一组能够在酸性条件下催化磷酸单酯键的水解反应，生成磷酸和相应脂肪酸的一类疏基酶，在生物体内有机磷代谢和调节的过程中起着不可或缺的重要作用。生物体内能量转化受其酶活影响很大，进而致使生物体的生长发育进程受其左右。而在细胞内部，ACPase在促进碳水化合物转化和信息传递等生命活动中扮演着必不可少的重要角色。因此，它在临床诊断、植物培育、食品工业、药物制剂、环境保护和检测技术等领域有很高的利用价值。

ACPase广泛存在于生物界，从微生物如大肠杆菌、酵母菌到动、植物组织、人类的器官和体液等，都有其存在^[21]。从低等生物而言，目前已有从树状多节孢和4种海洋微藻中分离纯化出ACPase的报导，并对其酶学性质做了初步的研究；另外，由于真菌和其宿主的共生关系，它们分泌出的ACPase可帮助宿主植物降解土壤中的有机磷化合物，为植物提供含磷的营养素；在大肠杆菌的酸性磷酸酯酶研究方面，已经有学者通过基因工程构建出含有ACPase基因表达片段的工程菌，使其在菌体中进行高效表达。对于植物ACPase而言，它们大多分布于植物的器官或组织中。目前，已有小葱、绿豆、甘薯叶、麦芽、拟南芥等多种植物里的ACPase的分离纯化研究。在动物体内，ACPase主要分布于血液和各大人体器官中；在动物细胞内则以溶酶体中的含量为最高。在人体中，ACPase广泛定位在组织和体液中，其中前列腺的ACPase含量是最高的。目前已有对来自罗非鱼、工蜂及一些人体中的ACPase进行了研究，特别是ACPase的水平提高与前列腺癌、某些血液病之间的联系的研究尤为突出。

1.1.2 酸性磷酸酯酶的应用领域

（1）在临床诊断方面的应用

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