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摘 要

本课题研究从活性污泥中筛选出一株好氧苯酚降解功能菌（实验室编号SJY_0503），纯培养后，对其进行形态观察以及生理生化的特征分析，利用16S rDNA基因序列分析技术以及Biolog自动微生物分析系统进行分类鉴定，鉴定结果为芽胞杆菌属的苏云金芽孢杆菌。对其进行苯酚耐受性实验，在苯酚浓度为2000 mg/L时依然能生长，与现有报道的相似功能菌相比^[1]，具有更高的耐受性；利用高效液相色谱法（HPLC）对其进行苯酚降解率进行测定，在苯酚浓度为1000 mg/L时，在12 h时的苯酚降解率达20 %，在经过60 h的发酵降解后，含苯酚的发酵液中苯酚降解率可达99%以上^[21-22]。

关键词：苯酚降解；降解菌；分离；鉴定

Isolation and identification of phenol-degrading bacteria

Abstract

An aerobic degradation of phenol strain (Lab No. SJY_0503) was isolated from activated sludge in this research, and was observed on the analysis of the physiological and biochemical characteristics after pure culture. 16S rDNA gene sequence analysis and Biolog automatic microbial analysis system were used for classification and identification The result was Bacillus thuringiensis. Some experiments were carried out to test its tolerance of phenol, growth as usual in phenol concentration of 2000 mg/L, comparing to the similar functional strains of the existing reports ^[1], this strain had higher tolerance. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to test phenol degradation rate in 1000 mg/L phenol concentration of this functional strain. Phenol degradation rate had reached 20% in 12 hours, after 60 hours fermentation and degradation, the degradation rate of phenol in fermentation broth containing phenol could be more than 99% ^[21-22].

Key Words: phenol degradation;phenol-degrading bacteria; efficient degrading bacteria

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1 选题背景 1

1.2 国内外本课题研究领域的发展状况及发展趋势 1

1.3 研究的基础 2

1.3.1 16S rDNA基因序列分析技术 2

1.3.2 Biolog自动微生物分析系统鉴定 2

1.3.3 高效液相色谱 3

1.4本课题研究目的、内容以及预期目标 3

第二章 筛选分离纯化 3

2.1 取样和预处理 3

2.1.1 取样和预处理 3

2.2 富集培养 4

2.2.1 菌株的初筛 4

2.2.2 菌株的复筛 4

2.3 分离纯化 5

2.3.1 涂布分离 5

2.3.2 划线纯化 5

2.3.3 斜面保存 5

第三章 细菌的鉴定 6

3.1 生理生化鉴定 6

3.1.1 生理生化实验预处理 6

3.1.2 革兰氏染色： 6

3.1.2 氧化发酵试验： 6

3.1.3 甲基红实验 7

3.1.4 淀粉水解实验 8

3.1.5 葡萄糖酸盐氧化实验 8

3.2 16SrRNA基因序列分析法鉴定 9

3.2.1 DNA的提取 9

3.2.2 琼脂糖凝胶电泳图 10

3.3 Biolog自动微生物分析系统的运用 12

3.3.1 Biolog平板的制作 12

第四章 菌株SJY_0503对苯酚耐受性与降解率的初步测定 14

4.1 菌株SJY_0503对苯酚的耐受性测定 14

4.1.1 制作苯酚浓度梯度培养基 14

4.2 菌株SJY_0503对苯酚的降解率测定 15

4.2.1 菌种的培养 15

4.2.2 进行高效液相色谱前的预处理 15

4.2.3 高效液相色谱法测定苯酚含量 16

第五章 结果与分析 18

5.1 结果 18

5.2 分析 19

参考文献 19

致谢 21

附录 22

第一章 引言

1.1 选题背景

苯酚在制造工业中充当着很总要的角色，常被用来生产农药、塑胶、建筑材料等，也是化工工业中重要的原料或中间反应物^[2-3]。随着各行各业对苯酚使用量的迅速增加，各地方的含苯酚的废水排放量也迅猛增加。苯酚具有很强的毒性，且结构稳定，不易分解，一旦含有苯酚的污水被排放到自然水体中，它将污染水源，危害鱼类，即使浓度仅为5–25 mg/L，也会造成很大污染，因此，苯酚被列为优先控制污染物^[4]。目前，含有苯酚的废水的处理方法主要有物理、化学、生物等方法。生物方法中，投菌法虽然仍处于研究阶段，但已经显示出很大的优越性^[5]。从自然界获得的降解菌，通过驯化、纯化及改良，再次投入到污染源中，将苯酚作为唯一碳源，而代谢的产物无二次污染，因此不仅经济，并且安全，从而受到越来越多的关注^[6]。

1.2国内外本课题研究领域的发展状况及发展趋势

目前，国内外针对具有降解利用苯酚能力的微生物的科研大多集中在对菌种的分离和鉴定、对菌株降解利用苯酚的特性以及对苯酚的适应能力的探索上，目前共筛选获得57个属、212种苯酚降解菌^[8]，主要包括细菌和真菌两大类，如产碱菌属、假单胞菌属醋酸钙不动杆菌、根瘤菌属、皮状丝孢酵母、真氧产碱杆菌等^[9]。苯酚的降解效率不仅受降解苯酚的功能菌的种类影响，还会受外界因素的影响，常见外界因素有苯酚的浓度、菌种接种比例、pH值、T值、溶氧、培养基中阳离子、盐浓度、外加碳源等，这些影响因素不仅影响菌株降解苯酚的效率，还会影响科研中对不同菌株的降酚效率的对比。

随着科学技术的快速发展，现代化技术手段逐渐被运用到高效菌株的培育中，如Bárbara Safont等人将降解菌固定在环糊精颗粒上，以此提高降解速率^[10]；Galina Satchanska等人使用晶胶固定菌株^[11]。在国内也有人开始降解菌改良的研究，张黎等人将海藻酸钠作为一株苯酚高效降解菌的载体，对降解菌进行固定化包埋, 并通过不断的试验确定了制作降解菌固定化小球的最优方法^[12]；邱凌峰运用补料分批（Fed-batch）的方法培养菌株，该方法可以防止底物对实验产生抑制，并且菌液的生长很旺盛^[13]。张孝龙等人将筛选出的高效苯酚降解菌制备成相应的菌剂与碟管式反渗透(DTRO)技术组合形成“生物强化-DTRO”工艺，该工艺不仅可以有效去除废水中的酚类化合物，还能减少反渗透膜污染，以及增加膜的通透性^[14]。S. Sivasubramanian等人将5中降酚菌株混合，联合降解率得到很大提升^[15]。对高效率降解苯酚等有害成分的功能菌株的研究和应用技术已得到迅猛发展，由此可以期待，在不久的将来，将降酚菌株用于处理工业废水的想法必将不再是设想，而是能切实运用的生物方法实。

1.3研究的基础

1.3.1 16S rDNA基因序列分析技术

16S rRNA在生物体蛋白质合成过程中是必不可少的，当16S rRNA基因序列同源性超过97%时我们可以认为比对的两者是同种，而当同源性小于93%~95%，则判断为不同属。该分析技术利用待鉴定的微生物中扩增16S rDNA基因片段，通过复制、检测获得16S rDNA序列信息，再与GenBank的数据库中的16S rDNA基因序列进行比对和同源性分析比较，建构系统发育树，了解该微生物与其他种属之间在遗传进化过程中的远近关系（系统发育关系），从而达到对该种微生物所属种类鉴定的目的^[8]。

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