论文总字数：29793字

摘 要

经济的发展伴随着人们生活习惯的变化，以蔗糖为代表的传统食品添加剂的大量使用导致了人类“富贵病”的产生。因此开发健康的功能糖以代替蔗糖具有重要意义。异麦芽酮糖是一种新型的功能性糖，它的生产是通过蔗糖异构酶催化底物蔗糖得到的。

本文构建了含有蔗糖异构酶基因（palI, 源于Erwinia rhapontici NX-5）的重组诱导型穿梭质粒pHA01-palI并将其转化至Bacillus subtilis WB800中，以实现蔗糖异构酶的高效食品安全型表达。并且利用单因子优化法优化发酵产酶时的诱导时机、诱导温度、时间和诱导剂浓度，确定B. subtilis WB800-pHA01-palI产酶的最佳诱导方式。接着对重组菌的发酵条件进行研究，包括碳源、氮源、初始pH、接种量以及溶氧等因素，讨论了这些参数对重组菌生长及酶的表达的影响。

关键词：枯草芽孢杆菌 蔗糖异构酶 表达条件优化 高密度发酵

ABSTRACT

With the development of economy, people's living habits changed a lot. Therefore, excessive consumption of traditional food additives (sucrose) led the generation of "rich disease". Hence, it is important to substitute sucrose with functional sugar. Isomaltulose is a new type of functional sugar, and its production is generally catalyzed by sucrose isomerase (SIase) with sucrose as its substrate.

In this work, a recombinant shuttle plasmid pHA01-palI containing SIase gene from Erwinia rhapontici NX-5 (palI) was constructed and transformed into Bacillus subtilis WB800. For realizing the high expression of SIase in food safety way, the single factor optimization method was used to optimize induction method of B. subtilis WB800-pHA01-palI producing SIase, induction starting time, induction temperature, induction time, and concentration of inducer. In addition, the fermentation conditions of recombinant bacteria were studied, including carbon source, nitrogen source, initial pH, inoculum size, and dissolved oxygen. The effects of these parameters on the growth and enzyme expression of recombinant bacteria were discussed.

Key words: Bacillus subtilis Sucrose isomerase; Optimization of expressed condition; High density fermentation

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 i

第一章 前言 1

1.1 前言 1

1.2 功能糖简介 1

1.3 异麦芽酮糖简介 1

1.3.1 异麦芽酮糖的理化性质 1

1.3.2 异麦芽酮糖的制备方法 2

1.4 蔗糖异构酶的研究进展 3

1.4.1 蔗糖异构酶的来源与性质 3

1.4.2 蔗糖异构酶的异源表达 4

1.5本论文的研究意义与内容 5

第二章 食品级蔗糖异构酶产生菌构建及其发酵条件优化 7

2.1 前言 7

2.2 材料与方法 7

2.2.1 实验仪器和试剂 7

2.2.2 菌种与培养基 9

2.2.3 引物的设计与合成 9

2.2.4 诱导型穿梭质粒pHA01-palI的构建 10

2.2.5 枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化 11

2.2.6 蔗糖异构酶的表达条件的优化 12

2.2.7 重组菌B. subtilis WB800-pHA01-palI的发酵条件优化 13

2.2.8 7.5 L发酵罐重组菌生长和产酶过程分析 14

2.2.9 蔗糖异构酶的表达 14

2.2.10 分析方法 15

第三章 结果与讨论 16

3.1 食品级蔗糖异构酶产生菌构建 16

3.1.1 诱导型穿梭质粒pHA01的构建 16

3.1.2 重组表达载体的构建与鉴定 17

3.1.3 重组菌B. subtilis WB800-pHA01-palI的构建与鉴定 17

3.2重组菌B. subtilis WB800-pHA01-palI的表达条件的优化 17

3.3 重组菌B. subtilis WB800-pHA01-palI的酶活测定 20

3.4重组枯草芽孢杆菌的发酵条件优化 21

3.5 7.L发酵罐重组菌生长和产酶过程分析 25

第四章 结论与展望 27

4.1 总结 27

4.2 展望 27

参考文献 29

致谢 33

第一章 前言

1.1 前言

随着近年来经济的发展伴随着生活水平的提升，在饮食选择多重多样的前提下，人们以蔗 糖为首的传统食品添加剂的大量饮食，导致了“富贵病”的产生，例如肥胖、糖尿病、龋齿以及心脑 血 管 疾 病等。根 据2013 年 IDF的统计数据，全世界糖尿病 患者 高达 4亿人次，该病的发病率高达8.3%。更值得令人注意的是，我国糖尿病患者将近1亿人次，是全球糖尿病患者最多的国家，属于糖尿病高发地区。此外，全世界肥胖人数已从上世纪八十年代的900万快速增长到21亿。儿童中有八成以上的小孩患不同程度的口腔疾病—龋齿。显而易见，由蔗糖为首的传统甜味 剂 给人类带 来了一系列的身体健 康 问 题。因此，开发和制备绿色的具有保健作用的功能性糖以代替蔗糖为首的传统甜味剂具有重要的社会意义 。

1.2 功能糖简介

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