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摘 要

藻酸盐是海藻中广泛存在的一种海洋资源。褐藻胶裂解酶作为一种用于藻酸盐水解的环保型的生物催化剂，由细菌衍生而来，已经被广泛的应用在研究和工业生产低聚糖方向上。本研究鉴定通过从工业废水中分离出一种新的细菌粘质沙雷氏菌Serratia marcescens NJ‑07为原料，采用BCA测定法测定酶的蛋白质浓度，并通过改进后的二硝基水杨酸方法测量相对活性，并通过一些物理手段优化了裂解酶的活化作用。

研究鉴定结果如下：ALgNJ‑07的最适反应温度为40℃，最适反应pH值为9，最好热稳定性为20℃，最适保存pH区间为8‑10，该酶在40摄氏度温度下预孵育一小时仍能保留65％以上的酶活。其次加入了盐对AlgNJ‑07活性的影响的考察，研究鉴定表明在0.25M浓度的NaCl，褐藻胶裂解酶的活性最强。

由研究表明，pH值对裂解酶的活性影响要强于温度对其的影响，褐藻胶裂解酶反应时应处于40℃，pH 9的环境下，酶预孵育时应放置在20℃，pH 10 的环境下。

关键词： 褐藻胶裂解酶 粘质沙雷氏菌 BCA测定法 二硝基水杨酸法

Study on the Activity of Alginate Lyase in Serratia marcescens NJ- 07

ABSTRACT

Alginate is a kind of Marine resource that exists widely in seaweed. As a kind of environment-friendly biocatalyst for alginate hydrolysis, alginase is derived from bacteria and has been widely used in research and industrial production of oligosaccharides. This study identified by a new kind of bacteria was isolated from industrial wastewater Serratia marcescens Serratia marcescens NJ 07 as raw material, using BCA determination method was developed for the determination of enzyme protein concentration, and by the improved two nitro salicylic acid method, relative activity and by some physical means to optimize the cracking enzyme activation.

Study appraisal results are as follows: ALgNJ 07 the optimal reaction temperature of 40 ℃, the optimum pH value of 9, had better thermal stability is 20 ℃, the optimum pH range of 8 to 10, the enzyme at 40 degrees Celsius temperature prediction incubation an hour still can retain more than 65% of the enzyme activity. Secondly, the effect of salt on the activity of AlgNJ 07 was investigated, and it was found that NaCl at the concentration of 0.25M showed the strongest activity of alginic lyase.

By the study shows that the pH influence on lyase activity than temperature to its influence, alginate lyase reaction should be in 40 ℃, pH 9, enzymatic preparing incubation should be placed at 20 ℃, pH 10 to the environment.

Key words: Alginate lyase；Serratia marcescens；BCA assay； dinitrosalicylic acid method

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 前言 1

1.1课题研究背景 1

1.2褐藻胶裂解酶的分类 2

1.2.1 底物的专一性 2

1.2.2 成熟酶的分子量 2

1.2.3初级结构序列 2

1.3 褐藻酸裂解酶的制备 2

1.3.1海洋动物提取法 2

1.3.2海洋植物提取法 3

1.3.3海洋微生物提取法 3

1.4 褐藻胶裂解酶的作用方式 3

1.5 褐藻胶裂解酶的结构组成 3

1.6褐藻胶裂解酶的应用 4

1.6.1食品领域 4

1.6.2医药领域 4

1.6.3其他领域 4

1.7研究意义、目的和主要研究内容 5

1.7.1研究意义 5

1.7.2研究目的和内容 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料与设备 6

2.1.1菌种 6

2.1.2实验仪器设备 6

2.2 实验方法 6

2.2.1配置基础培养基 6

2.2.2培养条件优化 6

2.2.3改进的二硝基水杨酸法 7

2.2.4藻酸盐和寡糖酶解水解物的TLC 7

第三章 结果与讨论 7

3.1酶的纯化与分子量的分析 7

3.2 ALgNJ‑07的降解能力和降解的产物的分析 8

3.3对海藻酸盐在不同反应时间内产物的TLC的分析 10

3.4对不同低聚糖降解产物的薄层层析的分析 11

3.5 ALgNJ‑07的生物化学的表现特征 12

3.5.1温度对ALgNJ‑07的影响 12

3.5.2 pH值对ALgNJ‑07的影响 13

3.5.3 ALgNJ‑07的热稳定性的分析 13

3.5.4 AlgNJ-07的pH稳定性 14

3.5.5 AlgNJ-07残余活性的时间推移测量的分析 15

3.6 盐对ALgNJ‑07活性的影响 16

第四章 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.1.1 酶的纯化 18

4.1.2 ALgNJ-07的降解能力和降解产物的分析 18

4.1.3 ALgNJ-07的生物化学表现特征 18

4.2 展望 18

参考文献 20

致谢 23

第一章 前言

1.1课题研究背景

褐藻酸盐是褐藻细胞壁的主要成份，它被广泛应用于化工、制药、食品等行业。它是一个线性阴离子多糖，由α-L-guluronate(G)和C5差向异构体β-D-mannuronate(M)通过α-1,4糖苷键相连^[1]。两种单糖安排分为三种方式:poly-α-L -guluronate(polyG)，poly-β- D -mannuronate(polyM)和杂聚合物(polyMG)。藻酸盐具有较高的粘度和胶凝性能，因为它具有特定的单体组成(M/G比) ^[2]。藻酸盐的低聚糖具有多种特殊的生理功能和活性，具有很大的潜在价值^[3]。它们的功能依赖于特定的结构。Ji HyeYang et al.(2015)通过调节LDLR表达，发现藻酸盐低聚糖(AOS)降低血浆ldl -胆固醇水平。XitaoWang等人(2014)发现AOS可以增强海参体细胞体外非特异性免疫反应。Iwamoto等人(2005)认为，在未饱和的gulurate (G3-G9)和mannurate (M3-M9)低聚物中，从RAW264.7细胞中提取藻酸寡糖和细胞因子的诱导关系，发现G8和M7是最有效的活动^[4]。Yamamoto^[5-7]等人(2007)研究了gulurate (G3-G6)和mannurate (M3-M6) oligomers在RAW264.7细胞上的细胞因子诱导活动，他们发现藻酸盐寡聚物诱导细胞因子产生，如肿瘤坏死因子-alpha (TNF-alpha)，单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)，粒细胞巨噬细胞(GM)-CSF^[8]。在细胞因子诱导方面，m -寡聚体比g -寡聚体更有效。褐藻胶裂解酶是一种多糖裂解酶,通过糖苷键的β-elimination^[9-12]的催化作用并产生不饱和寡糖之间的双键C4和C5(黄et al . 2000年)。褐藻胶水解酶属于pl5、-6、-7、-14、-15、-17和-18科^[13-14]。褐藻胶水解酶按照底物分类有三种类型: polyM特异性裂解酶(EC 4.2.2.3)、polyG特异性裂解酶(ec4.2.2.11)和双功能裂解酶(EC 4.2.2.-) ^[15]。具体的溶酶可以广泛应用于制药或食品行业，获得特定的功能性褐藻酸寡糖。

1.2褐藻胶裂解酶的分类

褐藻胶裂解酶的分类目前概括起来有一下四种分类方式：

1.2.1 根据底物的专一性

按照底物的专一性的区别可分为三类：糖醛酸单体连接形成聚甘露糖醛酸酯嵌段（polyM-嵌段）、聚古罗糖醛酸酯嵌段（polyG-嵌段）和无规共聚物（polyMG-嵌段）。基于底物特异性，褐藻胶裂解酶可以表征为polyM，polyG和polyMG特异性裂解酶。 褐藻胶裂解酶与相应的底物特异性城市具有内切或外切去分级活性^[16]。

1.2.2 根据成熟酶的分子量

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