论文总字数：17421字

摘 要

基于线粒体COI基因的DNA条形码技术已经成为主要研究方法，尤其是在海鲜产品方面。目前我国市场上销售鱿鱼制品种类繁多，然而我国对于鱿鱼DNA条形码的系统研究较少。本研究采用通用引物对44个我国常见鱿鱼制品物种进行扩增、测序，并对序列进行分析。

结果发现，采用天根商业试剂盒法可以从所有样品中提取出高质量DNA，且所有样品均可以扩增出约657bp的线粒体COI条形码片段。序列比对分析发现，有42个样品可鉴定到属种，剩余的2个样品鉴定失败。鉴定的42个样品中有37个秘鲁茎柔鱼(Dosidicus gigas)，2个太平洋褶柔鱼（Todarodes pacificus），2个阿根廷鱿鱼（Illex argentinus），1个剑尖枪乌贼（Uroteuthis edulis）。

本课题的研究可为我国政府监管部门准确鉴定市场鱿鱼品种提供准确的途径，起到规范我国海鲜产品市场和保护消费者利益的作用。

关键词：DNA条形码 COI基因 鱿鱼制品 品种掺假

Application of DNA Barcode Technology in Species Identification of Squid Products

Abstract

DNA barcode technology based on mitochondrial COI gene has become the main research method, especially in seafood products. At present, there are many kinds of squid products on the market in China, but there are few systematic studies on squid DNA barcode in China. In this study, 44 common squid products in China were amplified and sequenced by universal primers, and their sequences were analyzed.

The results showed that high quality DNA could be extracted from all samples by Tiangen commercial kit, and all samples could amplify about 657 BP of mitochondrial COI barcode fragments. Sequence alignment analysis showed that 42 samples could be identified as genera and species, while the remaining 2 samples failed to identify. Of the 42 identified samples, 37 were Dosidicus gigas, 2 Todarodes pacificus, 2 Illex argentinus and 1 Uroteuthis edulis.

The research of this topic can provide an accurate way for our government to accurately identify the market squid species, and play a role in regulating the market of seafood products and protecting the interests of consumers.

Key words: DNA barcode COI gene Adulteration of squid products Adulteration of varieties

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 鱿鱼的简介 1

1.2 鱿鱼存在的食品安全问题 1

1.2.1甲醛含量超标 1

1.2.2 掺假问题 1

1.3 相关法律法规 2

1.4 基于DNA的鉴定技术 2

1.4.1 PCR-RFLP 2

1.4.2荧光定量PCR 3

1.4.3 DNA条形码 4

1.4.4 数据库 5

1.5 本项目的意义 5

第二章 材料与方法 6

2.1 样品采集 6

2.2 主要仪器 9

2.3 主要试剂 9

2.4 实验方法 10

2.4.1 DNA提取 10

2.4.2 DNA浓度和纯度测定 10

2.4.3 总DNA电泳 10

2.4.4 PCR扩增及测序 10

2.4 5序列比对与分析 11

第三章 实验结果与讨论 12

3.1 DNA 提取 12

3.2 PCR扩增与测序 13

3.3 序列比对与分析 15

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致 谢 19

文献综述

1.1鱿鱼的简介

鱿鱼，又称枪乌贼或柔鱼，以小虾、小公鱼、银汉鱼、沙丁鱼等作为食物，本身又作为凶猛鱼类的猎食对象之一，受精卵分批产出，分批成熟^[1]。主要分布于大西洋、印度洋和太平洋等海域，是世界上三大未充分开发利用，且具有很大开发潜力的海洋生物资源之一^[2]；其肉感柔滑，入口弹牙有嚼劲，富有营养，风味鲜美，被食客们称为海中珍品，深受消费者的喜爱^[3,4]。鱿鱼是一种重要的海洋生物资源，每年在我国鱿鱼捕获量高达37~42万吨，约占世界鱿鱼总捕获量的35%^[3,4]。目前海鲜市场中销售的鱿鱼种类主要是柔鱼科（Ommastrephidae）和枪乌贼科（Loligo），其中柔鱼科产量最多，约占世界总产量的 90%。在柔鱼科中，目前世界各国捕获的种类主要分为三种：太平洋褶柔鱼（T pacific）、阿根廷滑柔鱼（I argentinus）和秘鲁鱿鱼（D gigas）^[3-5]。

1.2 鱿鱼存在的食品安全问题

1.2.1甲醛含量超标

鱿鱼制品中甲醛含量超标主要有两个原因：一是违规添加，“福尔马林”是浓度36％～42％的甲醛水溶液的俗称，主要用途是消毒和防腐。鱿鱼在被清洗加工时，不法商贩们为了节约成本和让鱿鱼外观保持新鲜不腐烂变质，往往会违规加入甲醛水溶液。二是鱿鱼自身产生，经大量研究发现，内源性的甲醛会在鱿鱼自身体内会产生，再加上在加工、运输、储藏过程中的鱿鱼制品，会因周围环境条件或鱿鱼体内化学物质的变化，均可能会导致甲醛的产生，以至于鱿鱼制品中甲醛含量超标^[6-7]。

1.2.2 掺假问题

改革开放以来人们的消费能力上升了，对生活水平要求变得更高了，人们的购买欲望异常强烈，市场买卖非常繁荣，尤其是在海鲜市场，海鲜产品热销，导致供不应求。在这种环境下，有些黑心商户制为谋取暴利，制造假鱿鱼，这种假鱿鱼主要是用明胶、淀粉等添加剂合成。假鱿鱼的制作方法主要有两种：一是直接将明胶和淀粉的合成物直接充进鱿鱼内，增加重量和口感。二是做成各种鱿鱼的零食产品，并且加入各种色素。尽管假鱿鱼的口感和卖相都比真鱿鱼好，但是假鱿鱼的化学成分含量太高，甚至黑心商家们会加入只能用作工业方面的添加剂，这样做的后果会对消费者的身体健康造成严重的伤害^[8]。

1.3 相关法律法规

鱿鱼品种掺假导致的食品安全引起了我国以及全球的高度重视。根据欧盟理事会（EC）条例中No.1379 / 2013相关规定，海鲜产品包装上必须贴上商品名、学名、生产方法、生产场地、生产时间、保质期、捕捞区域和渔具种类等具体标签^[9]。在美国主要是由专门的食品安全机构（FDA）对食品供应安全和食品标签准确进行检测和审查。依据联邦制定的“食品药品化妆品法”、“包装和标签法”和“公共卫生服务法”等相应法律法规，在美国捕获、加工、分配和销售的水生动物必须贴有安全健康和详细的标签^[9]。

我国在2015年颁布的《中华人民共和国食品安全法》不仅加强了对消费者健康的保护，而且对食品安全相关违规行为的处罚也加大了力度^[10]。法律规定，在确定了其无证生产或违法添加的情况下，却依旧为其提供生产经营的场地，则违法者需被处罚最高10万元的罚款^[11]。另外，GB7718-2011《预包装食品标签通则》规定产品必须标识真实属性的专用名称，如生产商、生产日期、净含量等^[11]。

1.4 基于DNA的鉴定技术

伴随着技术水平的不断进步，在生物物种鉴定方面的方法也随之不断更新加强。主要是形态学、细胞学、生物化学、免疫学、分子生物学五个水平鉴定阶段^[12]。

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