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摘 要

黄曲霉毒素B1作为一种有害霉菌，针对其精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。本文设计了一条含有黄曲霉毒素（AFB1）核酸适配体的核酸茎环结构探针。当样品中含有AFB1时，AFB1会和其核酸适配体结合，打开核酸茎环结构，释放出一条引物链，促使发夹结构HP1/HP2发生链式杂交反应，在钾离子的作用下形成G-四联体。在此溶液中加入荧光探针NMM，NMM会嵌入到G-四联体中，游离状态的NMM荧光信号很弱，NMM嵌入到G-四联体中荧光信号显著增强。利用G-四联体中加入NMM体系前后荧光强度的变化，建立了一种简单快速、高效可行的检测黄曲霉毒素b1的新方法。该方法具有良好的灵敏度和优异的特异性。

关键词：黄曲霉毒素b1 G-四联体 NMM荧光探针 核酸适配体

Detection of aflatoxin B1 in foods based on G-quadruplex/fluorescent probe

Abstract

As a harmful mold, the development of precision detection technology of aflatoxin B1 is essential for food safety.It is found that aflatoxin (AFB1) reacts with the double-stranded aptamers to produce a chain of primers, which reacts with the HP1/HP2 of the hairpin structure to form the G-quadruple.

A simple, rapid, efficient and feasible method for the detection of aflatoxin b1 was established by using the change of fluorescence intensity before and after the addition of NMM system in G-quadruplex. Determine the reaction system by optimizing the concentration of aflatoxin b1, NMM concentration and reaction time and conduct specific experiments. This method has good sensitivity and excellent specificity.

Keywords: Aflatoxin; G-quadruplex; NMM; Aptamers

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 G-四联体 1

1.1.1 G-四联体的结构及多态性 1

1.1.2 G-四联体的生物功能及其重要性 3

1.1.3 G-四联体的荧光检测 3

1.2 NMM 5

1.2.1 NMM的分子形式 5

1.2.2 NMM分子探针检测黄曲霉毒素 5

第二章 实验流程 7

2.1实验原理和实验设备 7

2.1.1实验原料 7

2.1.3实验原理 7

2.2实验流程 8

2.2.1本实验所用溶液配置 8

2.2.2实验用试剂前处理 9

2.2.3形成G-四联体 9

2.2.4将NMM嵌入G四联体 9

2.2.5荧光信号检测 9

2.3原理验证 9

2.4条件优化 9

2.4.1NMM浓度测试 9

2.4.2 AFB1浓度的荧光发射测试 10

2.4.3不同样品的荧光发射测试 10

2.4.4反应时间对荧光信号强度影响测试 10

2.4.5样品分量计算 10

第三章 结果和讨论 12

3.1原理验证 12

3.2不同浓度NMM的荧光强度 12

3.3不同浓度AFB1的荧光发射光谱图 13

3.4时间对荧光发射影响 15

3.5AFB1针对OTA、SEB、ZON、OVA的特异性调查 16

第四章 总结 18

4.1实验总结 18

4.2展望 18

参考文献 21

致谢 23

第一章 绪论

G-四联体（G-quadruplex）是由富含鸟嘌呤碱基的核酸序列在钾、钠等金属离子诱导下在溶液中形成的一种特殊的核酸二级结构［1］。这种结构对基因表达、转录调控等具有重要作用，且在人体基因组和转录组中分布广泛。研究中新设计并合成了对G-四联体结构具有高特异性、高灵敏度识别能力的分子探针，并通过多种方法研究了其对G-四联体的识别作用，为G-四联体结构和生理功能的研究奠定了基础。

同时，食品安全检测技术发展迅速，其中分子识别元件是关键。核酸适配体（Aptamer）是利用体外筛选技术，“指数富集的配体系统进化”技术，从核酸分子文库中得到的一类单链寡核苷酸片段（DNA或RNA）［2］。Aptamer作为一种新型生物分子识别元件，在食品安全检测领域拥有巨大的应用前景。与抗体相比，aptamer筛选无需动物实验，可根据需要进行全化学合成，且筛选周期短，避免了抗体存在批次差异大的问题，可实现批量生产。此外，aptamer还具有易于修饰的优点，可根据不同分析目的有选择性地在aptamer末端修饰上各种活性基团（如氨基、磷酸基、巯基、荧光标记物、电化学标记物等）。最为重要的是，aptamer能够与靶分子发生特异性结合，且亲和力高、特异性强。据报道，aptamer可以与金属离子、小分子、生物大分子、微生物、甚至是细胞等多种靶标相结合，因而被广泛用于食品安全检测领域，随着纳米技术的快速发展，荧光纳米材料因具有荧光强度高、光稳定性优越、灵敏度高和设计多样化等特点，受到越来越多研究者们的关注［3］。将荧光纳米材料的高效信号转换、放大功能和aptamer特异性识别互补结合，研发aptamer荧光纳米探针，无疑为食品危害因子监测提供了一种新型、高效和快速的分析技术保障。

1.1 G-四联体

1.1.1 G-四联体的结构及多态性

DNA主要集中于细胞核内，其基本单位为脱氧核苷酸，包括四种碱基：腺嘌呤（dAMP）、鸟嘌呤（dGMP）、胸腺嘧啶（dTMP）和胞嘧啶（dCMT），碱基携带主要的遗传信息，它们通过3，5-磷酸二酯键连接形成的多聚脱氧核苷酸为ＤＮＡ的一级结构［4］。沃森和克里克在1953年提出DNA存在二级结构，即ＤＮＡ在一级结构的基础上，由碱基互补的两条链以Watson-Crick氢键配对反方向盘绕同一中心轴所形成的一种双螺旋结构。

除了DNA双螺旋结构外，G-四联体是的一种特殊的DNA二级结构，是由富含鸟嘌呤Ｇ的单链DNA序列通过自身折叠而成的兼具多样性与高度有序性的核酸结构。Ｇ－四联体由规则的共平面的四聚体结构堆积而成，也即G-四平面（G-quattet），每个G-四平面由四个鸟嘌呤构成，而相邻鸟嘌呤的相互连接是通过两者碱基之间的N₇和NH₂，O₆和N₁H间的八个氢键实现的（如图1-1所示）。G-四平面的中心、含有四个碳基氧O₆原子，可形成一个适合阳离子配位的带负电性的空腔。研究发现，带正电荷的一价阳离子通过配位可诱导富含鸟嚷吟的单链ＤＮＡ形成G-四联体（G-quadmplex）并对其结构起到重要的稳定作用。

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