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摘 要

利迪链霉菌是一种潜在的植物生防菌，对多种植物病害都有很好的防治效果，这与利迪链霉菌的代谢产物和胞外分泌酶类有关。本研究通过平板对峙的方法测定利迪链霉菌对数种致病菌的抑制效果，测定了利迪链霉菌的抗菌谱。进而通过实验测定菌体发酵液上清中的蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶的活性。结果显示，发酵过程中蛋白酶活最高为4.67U/ml,几丁质酶活性为2.65U/ml,葡聚糖酶活为0.87U/ml，它们的活力随着发酵时间的变化而变化，这些酶的活力影响着利迪链霉菌对病原菌的抑制效果。本研究为生防利迪链霉菌的对植物病害的生物防治提供了一定的研究基础。

关键词：利迪链霉菌 抗菌谱 酶活测定

Determination of antibacterial spectrum of streptomyces lydicus and activity detection of enzyme antibacterial substances

Abstract

Streptomyces lydicus is a pontential plant biological aontrol agent, which has a good control effect on a variety of plant diseases. This is related to the metabolites of Streptomyces and extracellular secretases. In this study, the inhibition effect of Streptomyces lydicus on several pathogenic bacteria was determined by the method of plate confrontation. In addition, the protease, chitinase and glucanase activities in the supernatant of bacterial fermentation broth were measured through experiments. The results showed that the maximum protease activity during fermentation was 4.67 U/ml, chitinase activity was 2.65 U/ml, and glucanase activity was 0.87 U/ml, and its activity changed with the change of fermentation time. The activity of these enzymes affects the inhibitory effect of Streptomyces lydicus on pathogenic bacteria. The research provides a certain research basis for the biological control of plant diseases caused by Streptomyces lydicus.

Keyword：Streptomyces lydius Antibacterial spectrum Enzyme activity determination

目录

摘要 2

Abstract 2

目录 4

第一章 前言 5

1.1链霉菌简介 5

1.2 选题背景 5

1.3 链霉菌的形态和构造 6

1.4 链霉菌的群体特征 6

1.4.1 固体培养基上 6

1.4.2 液体培养基上 7

1.5 蛋白酶简介及应用 7

1.6 几丁质酶简介及应用 7

1.7 葡聚糖酶简介及应用 8

1.8 本文思路 8

第二章 实验部分 9

2.1 实验方法 9

2.1.1 利迪链霉菌抗菌谱的测定 9

2.1.2 蛋白酶活性的测定方法 9

2.1.3 几丁质酶活性的测定方法 10

2.1.4 葡聚糖酶活性的测定方法 10

第三章 结果与讨论 12

3.1 利迪链霉菌抗菌谱测定结果 12

3.2蛋白酶活性测定结果 14

3.3 几丁质酶活性测定结果 14

3.4 葡聚糖酶活性测定结果 15

第四章 结论与展望 16

4.1 结论 16

4.2 展望 16

参考文献 18

第一章 前言

1.1链霉菌简介

放线菌是微生物中的一大类。放线菌是一类单细胞的，丝状的，陆生性强的，以分子繁殖方式为主的原核生物，并且对革兰氏染色呈阳性。相对原始的放线菌细胞是棒状分叉或仅具有基质菌丝，无气生菌丝，以诺卡氏菌为代表，菌落通常结构松散，附着力差，具有特征性颜色；典型的放线菌会生长出基内菌丝、气生菌丝和孢子丝，以链霉菌为代表，它们的菌落在早期很像细菌，到后期由于气生菌丝和分生孢子的形成，会变得干燥、粉状、经常有辐射皱折，其菌落一般质地密集，常有各种不同的颜色。放线菌在抗生素生产工业中非常重要，目前绝大多数抗生素都是由放线菌产生的，其抗真菌活性代谢产物一直是抗真菌类药物发现的重要源泉。^{[1，7，8，20]}

链霉菌是最典型的放线菌，同时也是放线菌中种类最多的属，一共有几百种；链霉菌属也是放线菌中产抗生素种类最多的属，一共可产生1000多种，如链霉素（streptomycin）、卡那霉素（kanamycin）等；此外，链霉菌还可以产生多种维生素、酶和酶抑制剂。大多数腐生型链霉菌在土壤中生长并降解有机物质，而其他微生物难以使用这些有机物。它们高度适应土壤环境，对土壤改良中具有积极意义。另外还有少数寄生型链霉菌可导致植物病害，比如疮痂链霉菌（S.scabies），可导致马铃薯和甜菜上结疮痂。

1.2 选题背景

近年来随着植物由于植物病害的大面积发生以及生化杀菌剂的大量使用，不仅严重影响了作物产量，还造成了严重的农药残留和病害菌耐药性的问题，严重影响了农业发展和食品安全^[9-11]。近年来国内发生比较严重的植物病害有番茄枯萎病、小麦根腐病、柑橘黑斑病。那么该怎样有效防治细菌性病害呢。

抗生素作为生物农药的重要部分，以其低毒性低残留的特点而著名^[4]。进过许多年的发展和探索，我国对于抗生素的筛选和发酵生产技术已经有了显著提升，先后研发了高效、低毒、低残留的农用抗菌抗生素和农用抗病毒抗生素，如农抗120、多抗霉素、井冈霉素和宁南霉素^[2,5,6]。而放线菌作为目前最大的抗生素产生菌种群，其中最大的属种链霉菌属，其中大多数菌的活性代谢产物一直是抗生素药物的重要源泉。本研究组致力于研究利迪链霉菌对各种植物致病菌的抗菌谱以及利迪链霉菌代谢产物中酶类物质的活性的测定，包括蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶。

1.3 链霉菌的形态和构造

链霉菌的形态构造模式图：

在电子显微镜下可以清楚地看到链霉菌细胞的丝状分枝。在营养生长阶段，菌丝体内通常是可分离的，并具有多核的单细胞状态。链霉菌的孢子在固体基质表面生长、发芽，然后径向扩展、分支、辐射到培养基的表面和内层，并形成大量明亮的、具有营养和代谢废物功能的菌丝，也称基质菌丝。同时不断向空间方向分化出颜色较深的、具有繁殖功能的菌丝，也称气生菌丝。再之后，大部分气生菌丝体成熟，分化成孢子丝，并通过横割分裂的方式，产生成串的分生孢子^[8]。

1.4 链霉菌的群体特征

1.4.1 固体培养基上

链霉菌具有基内菌丝和气生菌丝体，气生菌丝还会进一步分化出孢子丝以及形成成串的分生孢子，他们伸展在培养基内部和空间中，而且菌落上没有积水，所以链霉菌菌落和一般细菌的菌落有着明显的差别：干燥、不透明、质地密且不易挑起，表面有一层“干粉”，菌落正反面颜色不一致。^[8]

1.4.2 液体培养基上

在实验室对链霉菌进行摇瓶培养室，经常会发现在液面与瓶壁交界处粘贴着一圈菌苔，培养液清且不混，培养液中悬浮着许多珠状菌丝团，还有一些大型的菌丝团沉淀在摇瓶底部。^[8]

1.5 蛋白酶简介及应用

蛋白酶是一类催化蛋白质水解的酶的总称，广泛存在于动植物、微生物体内。在微生物中，产蛋白酶最多有霉菌、细菌，其次是放线菌等。蛋白酶是一种高度专一性的酶，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一类肽键，如胰蛋白酶专门水解碱性氨基酸（赖氨酸、包括精氨酸、组氨酸）之间的肽键。生活中由于动植物资源有限，工业生产蛋白酶主要由微生物发酵制备。^[15]

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