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摘 要

本论文针对鞘氨醇单胞菌产威兰胶后续脱色纯化能耗大，以及鞘氨醇单胞菌抗逆性差的问题，利用基因工程手段，成功敲除类胡萝卜色素合成关键基因，获得一株不产色素的威兰胶生产菌株，在此基础上敲入四氢嘧啶合成酶基因簇，优化确定了最佳诱导表达条件，即在添加0.4 mmol/L IPTG时，四氢嘧啶的合成最优，达到0.21g/L。研究了该重组菌株的抗逆性能，结果表明在高盐，高温条件下，尽管菌体生长有一定改善（增幅在2%-3%），但是威兰胶产量并无明显的变化。

关键词：威兰胶 色素缺陷 抗逆性 四氢嘧啶合成酶基因簇

Construction of a pigment-free stress-resistant sphingosine monocellular strain and its stress resistance research

Abstract

In order to solve the problems of high energy consumption for subsequent decolorization and purification of welan gum produced by Sphingomonas sp. and poor stress resistance of Sphingomonas sp., this paper successfully knocks out key genes for carotenoid pigment synthesis by genetic engineering methods to obtain a welan gum producing strain that does not produce pigment. On this basis, the tetrahydropyrimidine synthase gene cluster is knocked in, and the optimal induced expression conditions are optimized, i.e. when 0.4 mmol/L IPTG is added, the synthesis of tetrahydropyrimidine is optimal, reaching 0.21 g/L. The stress resistance of the recombinant strain was studied. The results showed that under the conditions of high salt and high temperature, although the growth of the strain was improved to some extent (the growth rate was 2%-3%), the yield of welan gum had no obvious change.

Key words: Welan gum; pigment defect; stress resistance; Tetrahydropyrimidine Synthesis Gene Cluster

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 威兰胶的研究进展 1

1.1.1 威兰胶的性质 1

1.1.2 威兰胶的生产 1

1.1.3 威兰胶的应用 2

1.2 微生物类胡萝卜色素的研究 3

1.2.1 微生物类胡萝卜素合成的研究 3

1.2.2 微生物多糖纯化，脱色处理 4

1.3 微生物的抗逆性 5

1.3.1 抗逆性菌株构建的意义 5

1.3.2 提高微生物抗逆性技术 6

1.4本论文的研究意义及研究内容 7

1.4.1研究意义 7

1.4.2研究内容 7

第二章 抗逆型色素生产缺陷菌株构建 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 实验仪器及试剂 8

2.1.2 菌株与质粒 10

2.2 实验方法 10

2.2.1 培养基与培养条件 10

2.2.2 菌株质粒及基因组的提取 11

2.2.3 目的DNA片段的扩增及纯化回收 11

2.2.4 crtB基因敲除载体及T7-ectABC敲入载体的构建 12

2.2.5 分析方法 13

2.3 结果与讨论 14

2.3.1 类胡萝卜素合成途径关键酶基因crtB敲除菌株构建 14

2.3.2 crtB基因敲除对威兰胶生产的影响 16

2.3.3 crtB基因敲除及ectABC整合表达对威兰胶发酵的影响 18

2.3.4 高效液相色谱测定四氢嘧啶含量 18

第三章 重组菌株抗逆性能考察 20

3.1 实验材料 20

3.1.1 实验试剂与仪器 20

3.1.2 实验菌种与培养条件 20

3.2 试验方法 20

3.2.1 菌的生长量OD_600nm 20

3.2.2 发酵液中威兰胶产量 20

3.2.2 发酵液中残糖 20

3.3 实验结果与讨论 20

3.3.1 耐高温的测定结果与分析 20

3.3.2 耐盐性的测定结果与分析 22

第四章 总结与展望 24

4.1 总结 24

4.2 展望 24

参考文献 25

致谢 27

第一章 绪论

1.1 威兰胶的研究进展

1.1.1 威兰胶的性质

威兰胶是一种胞外杂多糖由产碱杆菌分泌，英文名为Welan Gum，音译为威兰胶，过去也被称为s-130^[1]。威兰胶是由四糖单元（D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖）重复连接而形成的不同分子量的微生物多聚糖，分子量大约为10⁶~10^7[2]。其分子组成如图所示。根据测量分子量包括11.6-14.9%的葡萄糖醛酸，2.8-7.5%的乙醛基，分子内鼠李糖与葡萄糖摩尔数相近，甘露糖大约为两者的一半，其中葡萄糖基本上都是1,3连接，鼠李糖末端主要为1,4连接^[3]。Urbani等人的研究表明，威兰胶水溶液中主要发挥作用的是氢键和范德华力，前者连接侧链和主链，这也是威兰胶性质区别于别的微生物多糖的主要结构特点^[2]。侧链基团结构可以影响相应的溶液性质，而威兰胶拥有区别于结冷胶等微生物多糖的多种侧链，这使得威兰胶即使与其有相似的骨架结构，但是具备了更加优越的性质和实用价值。

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