ε-PL一般是由25-35个L-赖氨酸单体通过脱水缩合形成，分子量可达到3200-4500 Da，是目前发现的4种天然的聚氨基酸之一。而ε-PL在食品防腐剂、药物载体、食品增稠剂和药物保湿等方面起到重要作用，在多个领域具有广阔应用前景^[1]。

其具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，且具有安全性能高、水溶性好、热稳定性好等优点，是一种性能优良的生物防腐剂。目前，日本、韩国、美国等国家已经批准其作为食品防腐剂进行应用^[2]。同时鉴于其聚阳离子性，水溶性好，热稳定性好，生物可降解等显著特点，ε-PL及其衍生物具有广阔的应用前景，除了食品防腐剂还被利用在食疗剂、生物可降解纤维、乳化剂、高吸水性凝胶、抗癌增效剂、药物载体及生物芯片包衣等行业。此外，ε-PL在化妆品、基因载体、药物包被物、电子材料和环保材料等领域也具有广阔的开发和应用前景。相对于其巨大的市场需求，但目前世界上仅有日本实现了ε-PL工业化，ε-PL的生产还不能满足市场的需求，导致ε-PL市场价格居高不下，限制它的广泛应用^[3]。同时我国对于ε-PL研究也逐步从实验室阶段向工业化生产过渡⁵。总之，ε-PL作为一种具有巨大的应用潜力与商业价值的生物高分子，已成为众多学者的研究热点。

日前工业上一般采用S. albulus作为ε-PL的发酵生产菌株，它是1981年由Shima S和Sakai H筛选得到并进行分类鉴定的^[4]。ε-PL发酵生产的影响因素很多，包括菌株、培养基、培养条件等均与ε-PL的生产密切相关，各国学者也对ε-PL的生产条件进行了深入的探究。1998年，日本学者通过筛选赖氨酸的结构类似物(S)-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(S-AEC)的抗性菌株来遗传性地解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制,进而积累赖氨酸,再由聚赖氨酸聚合酶聚合，从而达到高产ε-PL的目的^[5]。2006年台湾学者将S. albulus IFO14147在发酵罐中进行批次补料发酵聚赖氨酸，通过控制两阶段的pH值和葡萄糖供给的控制产出高产量的ε-PL。第一阶段保持pH值为6.8培养48h，从而得到稳定的高密度细胞；第二阶段保持pH值为4.0，且当葡萄糖消耗后就不断添加以维持葡萄糖浓度为10g/L，从而增加了ε-PL的积累，同时也证明pH值的控制和葡萄糖的供给是增加聚赖氨酸的产量必不可少的。Guoliang Wang等发现亚铁离子能够影响Streptomyces diastatochromogenes CGMCC3145合成ε-PL。亚铁离子能够对代谢途径中主要的酶活和ε-PL生产中底物的消耗产生影响。当Streptomyces diastatochromogenes CGMCC3145中加入0.1mm亚铁离子培养72h，能够发现ε-PL的产量和菌体量分别增加29.2％和41.9％，同时消耗的葡萄糖的量、氨氮的含量和磷的含量也分别增加50％、67.6％和35.7％。而且通过酶活显示出蛋白酶、磷酸酶、谷氨酸脱氢酶以及天冬氨酸转氨酶的活性都有所增加。所以添加亚铁离子能够通过提高天冬氨酸盐产物进一步催化产生更多供ε-PL合成的赖氨酸前提，从而提高ε-PL的产量^[6]。张扬等通过固定化的方法，通过丝瓜瓤固定Kitasatospora sp. MY 5-36的菌丝体，从而使得单位体积的菌丝体量提升，最终ε-PL的发酵液中含量达到了34.11g/L，同时利用固定在丝瓜瓤上的菌丝体作为下一批次发酵的种子进行重复批次发酵大大提高了发酵的效率，节约了发酵时间和成本。Jun Xia等人从 S. albulus PD-1生产ε-PL的发酵液中纯化得到聚二氨基丙酸（PDAP），PDAP是一种新颖的非蛋白氨基酸低聚物，并且能够很好的抑制酵母的活力。同时Jun Xia等人发现在 S. albulus PD-1发酵时，向培养基中添加柠檬酸培养时能够抑制PDAP的产生，从而增加ε-PL的产量^[7]。总之通过对菌种的筛选、诱变以及发酵条件的优化，现在ε-PL的生产水平已经有了很大程度的提高。但是这些实验大部分都集中在ε-PL的发酵调控，而对ε-PL的合成机制研究很少涉及。

本实验核心技术为结合转移技术，研究者们很早就发现了质粒可以转移的现象，但大部分认为这种现象的发生仅存在于种属关系较近的细菌之间^[8]。Trieucuot等构建了一种可以用于穿梭的质粒，并通过结合转移技术将质粒转入到一些格兰氏阳性细菌中。结合转移已经成为人们对链霉菌遗传操作的一种有效的技术，结合转移技术已经广泛运用于多个链霉菌的转化中，如弗氏链霉菌、变铅青链霉菌、肉桂地链霉菌等链霉菌^[9]。2000-2006年间，Hamano等利用基于S.albulus IFO14147内源质粒复制子构建的复制型质粒建立了适用于S#183;albulus IFO14147的结合转移体系，并借助此遗传转化体系进行了ε-PL的合成机制探索^[10]。但由于此工作是基于S.albulus IFO14147内源质粒复制子展开的，并不能成为其他ε-PL产生菌株所借用，尽管近年来多个ε-PL研究小组指出ε-PL产生菌株遗传转化体系构建的重要性，但是由于放线菌丝状菌体形态、较厚的细胞壁以及较长的生长周期等特点，未见有其他关于ε-PL生产菌株遗传转化体系及其分子改造的报道^[11]。本课题组近年来首次建立了适用于ε-PL生产菌株S.albulus PD-1的遗传转化体系，这一体系的建立对ε-PL的生物合成以及其高产菌株的构建都具有重要的意义，为将来ε-PL生产菌株在分子水平上的研究开启了一扇大门^[12]。

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL) 一般是由 25 ～35 个 L-赖氨酸单体通过 α-COOH 和ε- NH2 脱水缩合而成的同型 L-赖氨酸聚合物。据相关文献报道，补充前体物 L- 赖氨酸可有助于 ε-PL 聚合，但不同类型菌株对前体物的适应性不同，有的可以产生促进作用，有的却是产生抑制作用^[13]。

结合本实验室已有的工作发现，添加 L- 赖氨酸对ε-PL 的合成作用并无明显作用，可能是因为添加赖氨酸对 S.albulus PD-1 的天冬氨酸激酶产生了反馈抑制，导致 L-赖氨酸成途径受到抑制，因而聚赖氨酸的产量没有得到明显的提升^[14]。

天冬氨酸激酶作为赖氨酸生物合成途径中第一个关键酶，对产物积累有至关重要的作用,其活性受途径末端产物赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制。拟通过过表达天冬氨酸激酶基因，提高天冬氨酸激酶活性，解除反馈抑制，从而提高 ε-PL 的产量^[15]。

参考文献

[1]. Shima S, Sakai H. 1977. Polylysine produced by Streptomyces. Agric. Biol. Chem. 41: 1807-1809.

[2]Yoshida, T., Nagasawa, T., 2003. ε-Poly-L-lysine: microbial production, biodegradation and application potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 21#8211;26.