1.本课题研究的问题以及意义

碱性蛋白酶作为在工业、农业、食品、环保等方面重要的酶类，目前的研究重点在于寻找具有高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型蛋白酶。浩瀚的海洋以其独特和多样的生态环境，形成了有别于其它环境的独特而丰富的海洋微生物资源，并产生种类繁多的具有独特结构和功能的生物活性物质，因此，从海洋微生物中寻找并筛选出特异活性的碱性蛋白酶是一个值得研究的课题。

本实验从海水退潮是浅滩土壤（海泥）中取样，经过提取细菌，嗜碱菌分离纯化，最终获得拥有产碱性蛋白酶能力的细菌。随后再通过观察菌株生长后，测定水解圈直径（ d ）和菌落直径（ D ）的比值来进行产碱性蛋白酶细菌的初筛，然后利用酶活力的测定来进行产碱性蛋白酶细菌的复筛，挑选出产酶能力最优良的菌株。

2.本课题的研究手段

首先，将取得的样本接种到富集培养基上培养，获得富含野生海洋细菌的培养基；

接着，将培养取得的海洋细菌按10倍稀释法稀释到10^-1，再稀释10^-2，10^-3，10^-4接种到分离纯化培养基上，然后取4个试管中样液于相应分离纯化用培养基平皿上用划线法培养。37℃培养24h，观察并挑选出单个菌落，对分离得到的菌株进一步分离纯化。

观察分离纯化用培养基上菌落形态，从中挑选出白色的、光滑的单菌落，用点种的形式接到脱脂牛奶琼脂培养基（初筛用培养基）上培养。

将初筛用培养基（脱脂牛奶琼脂培养基）分为四区，并做好标记区分开，将划线分离纯化的菌株以点种的形式接种于培养基平板上，37℃培养24h，如果点种的菌株能够产生碱性蛋白酶，则在平板上会产生水解圈。通过测定水解圈直径（d）和菌落直径（D）的大小，并求其比值，即可确定该菌株产酶能力的相对大小。d/D的值越大，则菌株产酶能力越强。

接着进行产碱性蛋白酶细菌的复筛。测定产碱性蛋白酶细菌的酶活力，挑选出酶活力最好的菌株，即为该样本中所能够获得的最优产碱性蛋白酶细菌。