文 献 综 述

1 谷氨酸棒杆菌研究背景

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为重要的工业微生物，已被广泛应用于发酵工业、生物催化和环境治理等领域，尤其用于氨基酸的发酵生产已有60多年的历史，已报道的产量最大的氨基酸如L-谷氨酸、L-赖氨酸全部由C. glutamicum的突变株生产得到。以C. glutamicum ATCC 13032为代表的多株谷氨酸棒杆菌基因组测序的完成为利用系统代谢工程与合成生物学技术对菌株进行设计与改造提供了大量的信息和技术支持，通过分析基因组网络信息，界定物质与能量代谢的功能模块，找出与目的产物积累相关的途径及关键酶，设计并优化人工合成目标，在谷氨酸棒杆菌底盘细胞中系统进行检测评价及功能替换，获得代谢途径的最佳物质流、能量流与信息流分布，可以最大化积累目的产物，从而构建出具备理想特征的谷氨酸棒杆菌细胞工厂，现在已有许多成功的实例。

L-精氨酸系列氨基酸主要包括L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸，在人体内同时参与尿素循环，对维持哺乳动物细胞环境中铵离子浓度起着非常重要的作用。L-精氨酸系列氨基酸具有重要的生理作用，已被广泛用于医药领域和食品工业，具有良好的市场前景。发酵法已在L-精氨酸的工业生产中广泛应用， L-鸟氨酸和L-瓜氨酸发酵法通常采用精氨酸缺陷型菌种，在已有精氨酸高产菌基础上筛选精氨酸缺陷型可以随机得到瓜氨酸或鸟氨酸高产菌株，但采用传统诱变法随机型较大，不易得到高产菌种，尤其是瓜氨酸高产菌株筛选条件更加难以确定。

在原核微生物中精氨酸合成途径经谷氨酸出发经历了8种酶催化而成，鸟氨酸和瓜氨酸作为中间产物分别了经历5步和6步反应催化生成。在C. glutamicum中精氨酸的合成采用乙酰鸟氨酸转移酶只具有脱下乙酰基团功能的经济循环途径，即乙酰鸟氨酸在由argJ基因编码的乙酰鸟氨酸转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时，乙酰基团被转移到谷氨酸形成乙酰谷氨酸。其中循环途径中乙酰鸟氨酸转移酶的的功能又可分为两类，单功能类即乙酰鸟氨酸转移酶只具有脱下乙酰基团的功能，和双功能类即乙酰鸟氨酸转移酶不但具有脱下乙酰基团功能，还有把乙酰基团转移到谷氨酸上形成乙酰谷氨酸的功能，被L-精氨酸反馈抑制的关键酶是N-乙酰谷氨酸激酶（argB编码）。2009年，日本Ikeda M等在对C. glutamincum A-27、I-30、D-77等菌株中argB、argR、argG的基因序列分析的基础上对C. glutamincum A-27菌株进行代谢改造，对argB基因定点突变的同时敲除了argR基因，构建了重组菌RBid，其发酵精氨酸产量可达80 g/L，为现有报道的最高值。国内江南大学饶志明教授课题组在钝齿棒杆菌中精氨酸合成途径调控机理方面进行了较深入的研究，通过产物反馈抑制的分子改造等一系列代谢工程改造，获得了国内产量最高的精氨酸生产菌株。

课题组前期研究以谷氨酸棒杆菌标准菌株C. glutamicum ATCC 13032和有自主知识产权的C. glutamicum 1006为研究对象，采用代谢工程策略，构建了L-瓜氨酸生产菌株并初步进行了代谢流分析，结果显示由CO₂与谷氨酰胺经氨甲酰磷酸合成酶（UPS）固定反应合成的氨甲酰磷酸，对L-精氨酸和L-瓜氨酸的生物合成起重要作用。目前，关于谷氨酸棒杆菌氨甲酰磷酸合成与分解代谢的研究报道还较少，基于该途径指导精氨酸系列氨基酸的合成仍处于空白。氨甲酰磷酸作为重要的高能磷酸化合物及精氨酸和嘧啶合成所必需的前体物质，系统解析其途径与调控机制，对进一步优化谷氨酸棒杆菌作为底盘细胞合成精氨酸系列氨基酸及其衍生物具有重要的理论意义与应用价值。

2 国内外谷氨酸棒杆菌氨甲酰磷酸途径研究概况

氨甲酰磷酸的产生需要氨甲酰磷酸合成酶（UPS）催化谷氨酰胺、CO₂和ATP合成，在谷氨酸棒杆菌和大多数微生物中，UPS是由相邻的基因carA、carB编码，carA基因编码UPS的小亚基，此亚基以谷氨酰胺为底物将其氨基基团转至由carB基因编码的大亚基连接氨基的位点上，大亚基则催化CO₂、ATP及NH₄ 形成氨甲酰磷酸。在大肠杆菌和沙门氏菌中对其研究较多，可以更详细的了解氨甲酰磷酸生成机制。首先氨甲酰磷酸合成酶活性受到UMP的抑制，但IMP和鸟氨酸可以竞争性的解除UMP的抑制。随着精氨酸浓度的升高，会抑制合成途径酶的活性，减少鸟氨酸的生成，降低氨甲酰磷酸的合成。氨甲酰磷酸合成酶受到精氨酸和UMP的双重调控，并且抑制作用具有累积性。但当鸟氨酸达到饱和浓度时可以减弱UMP抑制酶活作用，而当鸟氨酸缺乏时会加剧抑制酶活性。天津科技大学陈宁教授课题组通过对重组大肠杆菌氨甲酰磷酸途径的改造增强了嘧啶途径中胞苷的合成。另外研究发现在一些真核微生物中，氨甲酰磷酸的合成可由两种氨甲酰磷酸合成酶催化，一种酶受到精氨酸的调控，另一种酶受到嘧啶的调控，这些研究结果可对谷氨酸棒杆菌中开展氨甲酰磷酸途径代谢调控的研究提供有益借鉴。

课题组在前期研究中以谷氨酸棒杆菌标准菌株C. glutamicum ATCC 13032和有自主知识产权的鸟氨酸高产菌株C. glutamicum 1006作为出发菌株构建L-瓜氨酸产生菌，L-瓜氨酸最高产量达到20.11 g/L（数据待发表），但该发酵过程仍有一定量的前体物质L-鸟氨酸生成。通过建立谷氨酸棒杆菌精氨酸系列氨基酸代谢途径模型并进行了代谢流分析，根据谷氨酸棒杆菌氨基酸生产途径并结合一些较合理的原则或假设建立了代谢网络计算模型，计算得到L-瓜氨酸的理论糖酸转化率达到85%，根据发酵实验结果，计算得到了谷氨酸棒杆菌L-瓜氨酸发酵生产的代谢流分布，并与理论计算得到的瓜氨酸生产的最优流分布进行比较发现，谷氨酸棒杆菌发酵生产瓜氨酸在实际过程中，大量的代谢流流量消耗在三羧酸循环内部，直接导致大部分碳骨架被转化为CO₂释放到体外，因而适当增强回补途径以其氨甲酰磷酸合成酶活性以固定CO₂应该有利于精氨酸系列氨基酸的积累。根据这个思路，我们在构建的L-瓜氨酸产生菌中外源添加一定量的氨甲酰磷酸，发现其对菌株生长与L-瓜氨酸、L-鸟氨酸的积累均有一定影响。一方面，菌体生物量有所增加，这可能是由于氨甲酰磷酸的增加增强了嘧啶合成代谢并改变了胞内能量代谢，这些对菌体生长有重要影响；另一方面，工程菌的L-瓜氨酸产量提高了10-15%，L-鸟氨酸产量有所下降，显示氨甲酰磷酸的增加促进了L-鸟氨酸向L-瓜氨酸的转化，但值得注意的是，由于同时伴随着菌体生长的提升，单位菌体的产酸量是下降的，这也就使如何有效调控氨甲酰磷酸在精氨酸合成代谢、嘧啶合成代谢和胞内能量代谢中的通量分配成为本课题所要研究的关键共性问题。