摘 要

1，5戊二胺与是一种极具作用的优秀的化工产品，它在多领域都有着突出作用，包括化工·食品·医药·农业等领域。尤其在化工方面因为它与重要化工产品在结构和性质上相似，所以可以用作己二胺的替代品用于化工生产。由于己二胺的生产依赖于石油产品，所以社会生产上，对戊二胺的需求量日益增长。如何增加戊二胺产量成了亟待解决的问题。生物法合成戊二胺是一种颇受青睐的生产方法。微生物生产戊二胺是一种不错的生物合成法，本文就选择了大肠杆菌菌株来作为起始菌株，通过研究和改造大肠杆菌的代谢途径来提高大肠杆菌的戊二胺产量。本文拟定通过删除大肠杆菌中由speE speG patA Puua等四个基因编码的代谢支路来减少戊二胺在大肠杆菌胞内的降解量来提高戊二胺的终产量。运用CRISPR/Cas9基因编辑技术来达成该目的。

关键词：1-5戊二胺 代谢支路 CRISPR/Cas9 大肠杆菌

Construction of 1, 5-pentylenediamine resistant escherichia coli based on CRISPR/Cas9 gene editing technology

Abstract

1,5 pentylenediamine and is a very effective excellent chemical products, it has a prominent role in many fields, including chemical, food, medicine, agriculture and other fields.Especially in the chemical industry because it is similar to the important chemical products on the structures and properties, so pentylenediamine can replace hexanediamine in chemical production.Because of adipic amine production dependent on oil products, so the social production, the growing demand of glutaric amine of, how to increase the output of glutaric amine are questions to be solved.Biosynthesis of pentylenediamine is a popular production method.Glutarylamine production by microorganism is a good biosynthesis method. In this paper, we used e. coli strain to be the starting strain, by studying and modifying the metabolic pathway of escherichia coli, the glutinediamine yield of escherichia coli was increased The aim of this study was to reduce the intracellular degradation of pentylenediamine and improve the final yield of pentylenediamine by removing the metabolic pathways encoded by speE, speG, patA and Puua genes in escherichia coli. This article used the CRISPR/Cas9 gene editing technology to achieve experimental purpose.

Key words: 1-5 pentylenediamine;metabolism branch;CRISPR/Cas9;escherichia coli

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1戊二胺的发现及作用 1

1.2戊二胺的应用 1

1.3戊二胺与大肠杆菌 2

1.4戊二胺代谢 2

1.5CRISPR/Cas9基因编辑技术 3

第二章材料与方法 4

2.1实验菌株 4

2.2实验仪器 4

2.3实验试剂 4

2.4培养基 5

2.5引物设计 5

2.6构建突变SgRNA质粒和Donor DNA 7

2.6.1构建Donor DNA 7

2.6.2构建突变SgRNA质粒 8

2.6.3引物合成pcr 8

2.6.4核酸胶回收 9

2.7质粒提取 9

2.8感受态细胞制备 10

2.8.1感受态细胞制备 10

2.8.2含有卡那霉素抗性感受态细胞制备 10

2.8.3含有cas9质粒的卡那霉素抗性感受态制备 11

2.9基因敲除 11

2.10菌落pcr 12

2.11摇瓶发酵验证 13

2.11.1摇瓶发酵 13

第三章结果和讨论 14

3.1菌落pcr结果 14

3.2摇瓶发酵验证 15

3.3发酵罐发酵验证 16

第四章结论和展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1戊二胺的发现及作用

1，5戊二胺又被称作尸胺，是多种具有活性的天然多胺之一，在原核生物及真核生物中都有发现^［1］。1885年，在尸体中第一次被发现，发现者是来自德国的一名医师Ludwig Brieger，因为是从开始腐烂的尸体里发现的，所以得到了尸胺这一别称^［2］。后续研究发现它能在生物体细胞内由赖氨酸脱羧酶通过脱羧作用将L-赖氨酸直接转化而来。戊二胺具有多种生理功能，它是革兰氏阴性菌中肽聚糖的重要成分，同时它在微生物中起着协调生物体内铁离子浓度的作用^［3-5］，戊二胺同时能应用于细胞膜通道形成蛋白的关闭，也能保护大肠杆菌不被氧分子伤害^［6-8］；同时戊二胺也能抑制某些抗生素产生作用，因为在胞内较高浓度的戊二胺戊二胺会使外细胞膜渗透性降低^［9-11］。

1.2戊二胺的应用

戊二胺在多个领域中都有运用，比如农业，医药，食品，化工等领域。在医学领域它也可以用于治疗痢疾^［12］，在农业上，戊二胺可以改善坐果率和以及促进果实的发育，提高水果产量^［13-14］。在化工领域，他可以和二元酸通过聚合反应合成新型尼龙，同时因为它与石油化工产物己二胺在结构及性质上相似，因此它可作为己二胺的替代品，能够用于生产聚酰胺，聚氨酯，和重金属结合剂等产品。特别是聚酰胺54是由戊二胺和琥珀酸缩聚而成。聚酰胺54有望成为传统石油基聚酰胺的生物基替代品，其全球市场年产量为350万吨^［15-18］。现如今国际油价日益增长，石油资源日益短缺，同时石油的生产对环境造成了巨大的污染。我们需要采取措施，来解决这种情况。不同于作为石油化工产品的己二胺，戊二胺可以通过生物合成，因此可以大大降低对作为石油化工产品的己二胺的需求量。到目前为止，戊二胺一般可以通过微生物发酵和全细胞催化生产这两种方法得到。戊二胺的生物合成前体是L赖氨酸，在微生物发酵方法中，较为常用的原始菌种是谷氨酸棒状杆菌跟大肠杆菌这两种菌种然后通过基因工程技术对菌种进行改造获得高产赖氨酸菌种，本文选择对大肠杆菌进行改造，另辟途径通过减少戊二胺的代谢来提高戊二胺终产量。

1.3戊二胺与大肠杆菌