文 献 综 述

一、前言

无细胞蛋白合成技术作为一种有效高速的研究蛋白质转录翻译机制的生物工程手段，越来越多的被研究人员所重视。无细胞蛋白表达体系的研究源于1964年Nirenberg和Matthaei对于大肠杆菌无细胞合成蛋白质的预测性研究。他们应用大肠杆菌体外蛋白质合成机制破译编码20种氨基酸的64种密码子，编写出遗传密码字典，从而拉开了无细胞蛋白质表达体系研究的序幕。直至20世纪80年，SPirin等人对于无细胞体系的细胞抽提物和能量添加方式控制和调节的研究，提高了蛋白质的表达产率。在此基础上，无细胞体系的研究得到了生物学领域和生物工程领域许多学者的重视，无细胞蛋白表达体系也成为现代生物工程领域研究的前沿和热门。多种原核和真核的无细胞蛋白表达体系随之产生。但是利用谷氨酸棒杆菌无细胞体系合成乳酸系统还尚未有人涉及，在此我们做进一步研究。

二、无细胞表达体系应用的能量体系

能量物质是无细胞表达体系最为重要的成分，不仅在蛋白质合成过程中需要消耗大量的ATP只无细胞抽提物中的各种磷酸酶的存在也会快速的降解ATP等物质，生成无机磷酸而抑制蛋白质的合成。在无细胞表达体系中除了直接加入ATP外，许多的研究者根据ATP产生的生物学机理，应用氧化磷酸化和底物水平磷酸化作用的中间产物可以作为ATP再生的二次能源物质，将其直接加入到无细胞蛋白反应体系中，按照生成能量的途径再生ATP。目前研究发现磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)，丙酮酸，葡萄糖六磷酸，果糖一1，6一二磷酸，磷酸肌酸 (CP)均可作为ATP再生的二次能源物质。而葡萄糖六磷酸和丙酮酸是糖降解途径的第一个物质和最后一个物质。这说明糖降解途径中的所有中间物质在理论上均可以作为无细胞反应体系产生ATP的二次能源物质。

添加带有高能磷酸键的二次能源物质和相应的酶来促进无细胞体系中能量ATP的产生。不同的二次能源物质共同构成一个复杂的体系。PEP和丙酮酸均能够在代谢的过程中产生ATP，但是PEP的商品价格比较昂贵，并且在产生ATP的过程中同时产生了抑制蛋白表达的无机磷酸。

不同的能量体系具有自己不同的特点，将PEP，CP和丙酮酸作为二次能量物质的三种能源系统作用机理和相互联系。如何稳定产生ATP并能够在此基础上最大量的降低无机磷酸在无细胞体系中的浓度是无细胞体系构建和优化过程中要仔细考虑的问题。这一过程的重现也是生物体糖降解过程，底物水平磷酸化和氧化磷酸化过程的生物学应用的具体体现。是生物学理论知识和实践结合最为密切的部分。充分体现出将生物细胞内的生化反应在体外重现的可能性，具有深远的意义。

三、无细胞反应体系的优缺点

与传统的体内蛋白质表达系统相比，无细胞蛋白表达系统具有以下显著优点:

l)反应时间比较短，且反应操作简便，反应条件温和。只需加入抽提物、模板和各种必需的反应底物如能量，相应的盐离子，就可以快速表达目的蛋白。如同PCR技术实现了DNA的快速扩增，无细胞系统使得快速表达外源蛋白成为可能。

2)可用于表达对细胞(特别是细胞膜)有毒害作用的蛋白，避免毒性蛋白对宿主细胞的致死作用。例如膜蛋白的表达，大量表达的膜蛋白，需要固定在膜上，如果应用大肠杆菌等细胞表达，表达的蛋白固定在细胞膜上，将会造成细菌细胞膜的破坏，最终导致细胞死亡。

3)不仅能够应用DNA分子如质粒等作为反应的模板，还能够直接以PCR产物为模板表达蛋白，这样能够进行突变蛋白的快速筛选，实现蛋白分子的体外定向进化。4)含有非天然氨基酸和同位素的蛋白表达。可通过加入人工合成的氨基乙tRNA，合成含有非天然氨基酸(如D-氨基酸)或用同位素标记的蛋白质。

5)可以通过控制体外反应条件，如CECF反应器的研究，降低反应体系中副产物的含量，避免包涵体的形成。

6)抽提物的制备，保留有用的细胞代谢酶，除去细胞膜等物质，能够减少内源蛋白酶对目标蛋白质的攻击。使大部分的代谢能源集中用于合成目标蛋白质，而不会消耗在细胞生长等其他过程。

7)可通过直接调节控制反应条件灵活地控制蛋白质的合成，以及翻译后的蛋白质加工折叠修饰。

8)反应可在多孔板(例96孔板)上进行，满足高通量药物筛选和蛋白质组学研究的要求。

9)应用范围广泛，不仅能够表达蛋白酶，同时可以大量表达膜蛋白，对于酶学研究，膜蛋白研究，发挥基础作用。同时无细胞蛋白表达体系也存在着不少的缺点。首先，无细胞试剂昂贵，尤其是能量物质，占无细胞体系总消费的51.4%。其次，无细胞蛋白表达体系还不是很完善，研究的还不是很彻底，还有许多需要研究的方向。它不能表达所有的蛋白，表达蛋白也不是全部都具有生物学活性。最后，无细胞研究的取材范围还不够广泛，还不是所有的生物材料都能够应用于无细胞抽提物的制备。

四、 谷氨酸棒杆菌简介

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)广泛分布在自然界中，其菌体为短杆状、无芽孢，菌落湿润、圆形。是一种好氧细菌，该菌于 1957 年由日本科学家发现，能利用糖类和有机酸作为唯一碳源和能源生长，在添加生物素的培养基中，于好氧的条件下可获得高产率的谷氨酸积累，因而被广泛的应用于微生物发酵生产氨基酸。目前全世界氨基酸的年产量超过 200 万吨并逐年增长，其中棒杆菌发酵生产占大部分，谷氨酸棒杆菌是目前生产上应用最为广泛的氨基酸生产菌，除谷氨酸外，还用于生产赖氨酸和苏氨酸等氨基酸类物质以及生物燃料和其他一些有机酸类。其在 DNA 重组产品生产方面具有潜在应用价值。

五、谷氨酸棒杆菌中L-乳酸的的生物合成途径

谷氨酸棒杆菌为好氧菌，目前的研究也大都集中在需氧的条件下进行氨基酸类物质的生产，由于在厌氧条件下其生长受到严重的抑制，因而研究较少。2005年 Okino 等研究了在厌氧条件下谷氨酸棒杆菌有机酸的代谢情况，发现在厌氧条件下谷氨酸棒杆菌有机酸的转化率很高，并且产生的酸类大部分为乳酸和琥珀酸，虽然在厌氧条件下菌体停止生长，但是可以维持 360h 以上的有机酸代谢，长时间的有机酸代谢使得谷氨酸棒杆菌具有在厌氧条件下持续发酵能力，有利于有机酸的高效生产。这一研究也为利用谷氨酸棒杆菌生产有机酸的研究打下了基础。参照 KEGG 中 Coryrnebacterium glutamicum ATCC 13032 的代谢途径绘制谷氨酸棒杆菌中生产乳酸的代谢途径，。可以看出在厌氧条件下谷氨酸棒杆菌中乳酸的生成途径主要包括糖酵解途径和磷酸戊糖途径。根据Okino 等人的研究谷氨酸棒杆菌在厌氧条件下主要的代谢产物为乳酸、琥珀酸和乙酸。相比于大肠杆菌和乳酸菌里五碳糖等摩尔转化为乳酸所带来的碳源浪费，在戊糖激酶和异构酶的作用下谷氨酸棒杆菌可以将 3mol 的五碳糖转化为5mol 的乳酸，其理论上的转化率达到了 100%，这也突出了谷氨酸棒杆菌在乳酸生产上的所能利用的碳源更加的广泛。从图中也可以看出，D-乳酸代谢生成过程中的关键节点是丙酮酸，而在谷氨酸棒杆菌中丙酮酸主要由 EMP 途径生成，其厌氧或微氧条件下，代谢主要流向乳

酸、琥珀酸和乙酸。根据目的产物的不同可以改造丙酮酸到这些途径的酶类，过表达或者失活某些代谢途径的酶类。因此，可以通过失活由丙酮酸到其他有机酸的酶类并同时导入 D-乳酸脱氢酶的方式来实现谷氨酸棒杆菌中 D-乳酸的高效生成。2008 年 Okino 等人进行了厌氧条件谷氨酸棒杆菌的有机酸发酵试验，在试验条件下其有机酸的得率达到 1.99mol 有机酸/mol 葡萄糖，其中每摩尔葡萄糖生产 1.73mol 乳酸、0.19mol 琥珀酸、0.07mol 乙酸。谷氨酸棒杆菌中产生的乳酸大部分为 L-乳酸，并且产生其它的有机酸，因此，为了获得高纯度、高产量的L-乳酸，可以采用基因敲除的手段阻断谷氨酸棒杆菌代谢途径中的 L-乳酸、琥珀酸和乙酸等副产物的代谢，并导入外源高活性的 L-乳酸脱氢酶基因，以此来获得高纯度、高产量的 L-乳酸产生菌。

通过对厌氧条件下谷氨酸棒杆菌中代谢途径的分析，可以发现利用厌氧条件下谷氨酸棒杆菌中高效的有机酸转化率可以实现在较低原料成本的情况下有机酸的生产，利用分子生物学手段阻断或降低 L-乳酸外其它有机酸的代谢途径，这样就有可能实现谷氨酸棒杆菌中L-乳酸的高效生产，具有很好的现实意义。

参考文献：

[1] Ye X, Honda K, Morimoto Y, Okano K, Ohtake H: Direct conversion of glucose to malate by synthetic metabolic engineering. Journal of biotechnology 2012.

[2] Zhang Y-HP: Simpler is better: high-yield and potential low-cost biofuels production through cell-free synthetic pathway biotransformation (SyPaB). ACS Catalysis 2011, 1(9):998-1009.

[3] Zhang Y, Sun J, Zhong J-J: Biofuel production by in vitro synthetic enzymatic pathway biotransformation. Current Opinion in Biotechnology 2010, 21(5):663-669.

[4] Zhang Y-HP, Myung S, You C, Zhu Z, Rollin JA: Toward low-cost biomanufacturing through in vitro synthetic biology: bottom-up design. Journal of Materials Chemistry 2011, 21(47):18877-18886.

[5] Kim DM, Swartz JR: Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell‐free protein synthesis. Biotechnology and bioengineering 2001, 74(4):309-316.

[6] Kim T-W, Keum J-W, Oh I-S, Choi C-Y, Park C-G, Kim D-M: Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of biotechnology 2006, 126(4):554-561.

[7] Calhoun KA, Swartz JR: Energizing cell‐free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and bioengineering 2005, 90(5):606-613.

[8] Jewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJ, Swartz JR: An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology. Molecular systems biology 2008, 4(1).

[9] Inui M, Murakami S, Okino S, Kawaguchi H, Vert#232;s AA, Yukawa H: Metabolic Analysis of Corynebacterium glutamicum during Lactate and Succinate Productions under Oxygen Deprivation Conditions. Journal of molecular microbiology and biotechnology 2004, 7(4):182-196.

[10] Pirie CM, De Mey M, Prather KLJ, Ajikumar PK: Integrating the protein and metabolic engineering toolkits for next-generation chemical biosynthesis. ACS chemical biology 2013.