1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1. 唾液酸类物质简介

唾液酸（sialic acid）最早由 blix 于 1936 年从唾液腺粘蛋白中提取分离得到，因而命名为唾液酸（blix，1936）。而后，klenk 由神经节甙脂（ganglio sides）中分离出结晶性的多羟基氨酸，并命名为神经氨酸（neuraminic acid，neu）klenk，1941）。二十年后，gottschalk（gottschalk，1951；gottschalk，1955）小组在检验粘蛋白中流感病毒的作用时，分离得到了唾液酸类化合物中最有代表性的 n-乙酰神经氨（n-acetyl-d-neuaminic acid，neu5ac）。随后各种类型的唾液酸陆续在不同的哺乳动物中发现。guntar blix，ernst klenk 和 alfred gottshalk成为唾液酸研究领域的先驱，并于上世纪五十年代建立了唾液酸类物质的命名规则（blix，1957），八十年代这一类物质的分类得到完善。到 1967 年，完全确定了唾液酸的立体构型（yu et al. 1969）。同时，科学家们惊奇地发现了唾液酸这一在生物体内广泛存在的物质一系列的重要的生物学功能。这一发现使人们了解到唾液酸与人类健康的紧密关系，同时也引起了科学家对这一神奇物质代谢的关注。其中，科学家 roland schauer 由于在唾液酸分布以及分析方面的大量成果而被称为唾液酸先生；saul roseman 工作小组在唾液酸的生物合成、转运、分解途径方面做出巨大贡献。随后，唾液酸的广泛用途被开发出来，化学合成、生物提取和酶法合成等方法也陆续提出。目前唾液酸廉价大量的合成方面的研究成为造福人类健康的迫切需要。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

本课题对全细胞催化生产 Neu5Ac 进行了系统研究。选用生物安全的大肠杆菌 K12 作为宿主，利用一种高效温度诱导表达系统实现了 N-乙酰葡萄糖胺异构酶和 N-乙酰神经氨酸醛缩酶（N-乙酰神经氨酸裂合酶）的单独表达和共表达，并利用构建的基因工程菌株，进行了 Neu5Ac 生产研究。首先研究了全细胞中酶的表达对 Neu5Ac 生产的影响，并使用了正交分析的方法对酶的表达条件进行了优化。把优化的条件下培养出的细胞用作催化剂进行 Neu5Ac 合成，同样条件下，可使 Neu5Ac 产量提高 50%。本研究还发现，在全细胞催化合成 Neu5Ac 过程中，全细胞生物催化法生产 N-乙酰神经氨酸研究VINeu5Ac 的产量不仅与酶活性有关，还和细胞浓度、细胞活性、酶活比等多种因素相关，需要综合考虑进行优化。

随后本研究针对全细胞催化生产 Neu5Ac 过程中的副反应问题进行了分析，发现生产 Neu5Ac 使用的两种底物丙酮酸和 GlcNAc，都可以被细胞消耗，造成底物的浪费，并且会给后续的产物分离纯化带来困难。分析还发现大肠杆菌GlcNAc 特异的磷酸糖转移酶系统（PTS）是 GlcNAc 被菌体利用的关键。因此，对大肠杆菌中 GlcNAc 特异性的 PTS 中的关键基因 nagE 进行了敲除，得到了缺陷株 E. coli DT26。使用该缺陷株作为为宿主进行 Neu5Ac 生产，同样条件下，Neu5Ac 产量比用大肠杆菌 K12 野生株作宿主高 57%，GlcNAc 的转化率提高了59%。对丙酮酸的代谢途径分析发现与丙酮酸代谢相关的丙酮酸合成酶（PpsA）、丙酮酸氧化酶（Pta）以及磷酸转乙酰酶（PckA）的基因敲除可能对减少丙酮酸副反应有帮助。因此，用相关缺陷株作为宿主进行了 Neu5Ac 合成，发现丙酮酸氧化酶（Pta）的缺陷株，可以减少反应体系中乙酸的积累。