论文总字数：20999字

南京工业大学

2014届毕业课题设计

课题名称： 腺苷高产菌发酵条件的优化研究

学院：生物与制药工程

学号：1309100325

姓名：喻理

指导老师：雍晓雨

目录

1.1 腺苷的研究背景 3

1.1.1腺苷的简介 3

1.1.2 腺苷的理化性质 3

1.1.3 腺苷的药理作用及其机制 4

1.1.4 腺苷的副作用 4

1.1.5 生产腺苷的微生物菌种 4

1.2腺苷的应用 4

1.2.1药物 4

1.2.2药物中间体 5

1.2.3 腺苷生产意义 5

1.3 腺苷的制备方法 5

1.3.1 发酵法 6

1.3.2 RNA降解法 6

1.3.3 化学合成 6

1.3.4 由次黄嘌呤合成腺苷 7

1.3.5 由肌苷合成腺苷 7

1.3.6 酶合成法 7

1.4 腺苷生产菌的特性 8

1.5 本课题研究目的、内容及意义 9

1.5.1 研究目的 9

1.5.2 研究意义 9

第二章 研究方法 10

2.1 正交试验设计表 10

2.1.1 正交试验设计表 10

2.1.2 正交表的性质 10

2.1.3 正交试验设计的安排 10

2.1.4 正交试验设计的极差分析 11

2.1.5 较优条件选择 11

2.1.6 正交试验设计的过程 12

2.2 响应曲面设计 12

2.2.1 响应曲面 12

2.2.2 方法 13

第三章 重组腺苷生产菌的摇瓶发酵条件优化 14

3.1 引言 14

3.2 实验材料 14

3.2.1 菌株和质粒 14

3.2.2 实验试剂 15

3.2.3 实验仪器与设备 15

3.2.4 培养基 16

3.3 实验方法 16

3.3.1 培养方法 16

3.3.2 分析方法 17

3.3.3 单因素实验 18

3.3.4 Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验 18

3.3.5 响应面中心复合实验 19

3.3.6 响应面模型验证 20

3.4 结果与讨论 20

3.4.1 腺苷的标准曲线 20

3.4.2重组菌摇瓶发酵的生长曲线绘制和腺苷产量测定 21

3.4.3不同酵母膏及其初始浓度对菌株M3-3摇瓶发酵腺苷产量的影响 22

3.4.4 Plackett-Burman试验筛选影响腺苷产量的显著因素 23

3.4.5 最陡爬坡试验 24

3.4.6 中心复合实验确定显著因素的最优水平 24

3.4.7 摇瓶发酵腺苷产量验证 28

参考文献 30

致谢 31

第一章 文献综述

1.1 腺苷的研究背景

1.1.1腺苷的简介

腺苷（Adenosine），学名腺嘌呤核苷（9-β-D-Ri-bofuranosyl adenine）是一种天然的内源性嘌呤核苷，各由核糖（呋喃核糖）与腺嘌呤的一部分组成，中间由β-N9-配糖键（β-N9-glycosidic bond）连结。属于核苷类小分子化合物。　腺苷在生物化学上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸（ATP）或腺苷双磷酸（ADP）形式转移能量，或是以环状腺苷单磷酸（cAMP）进行信号传递等。是一种心血管药物，同时还是其他核苷类药物合成的前体。此外腺苷也是一种抑制性神经传导物（inhibitory neurotransmitter），可能会促进睡眠。在工业上主要用处是作为医药品、生化试剂、合成抗病毒药物的医药中间体以及作为食品添加剂，在农业上可以作为动植物生长促进剂。

1.1.2 腺苷的理化性质

腺苷的学名9-β-D-喃核糖基腺嘌呤，分子式C10H13N5O4，分子量267.24，为含1.5分子水的无色针状结晶，于100℃真空处理失去结晶水，有微咸苦味，易溶于水，几乎不溶于醇和醚，易为烯无机酸水解得到腺嘌呤和D-核糖，熔点234-235℃，pK3.5（碱性基团），12.5（酸性基团）。有紫外吸收。腺苷的化学结构式如下图所示：

1.1.3 腺苷的药理作用及其机制

在人体内 ，腺苷是一种内源性嘌呤核苷酸，由AMP脱磷酸或腺苷高半胱氨酸水解而成，然后可在腺苷酸激酶的作用下磷酸化生成AMP，或在腺苷脱氨酶作用下脱氨基生成次黄嘌呤核苷(肌苷，Inosine, IR)和次黄嘌呤(Hypoxanthine, Hx )。它与相应的受体结合发生作用，其血浆水平变动范围在0.04-0.2μM，但它在人体内的半衰期极短，约0.6-10s。在心血管方面，腺苷是一种可靠的生理调节剂。临床上腺苷可被有效地作为一种血管舒张剂应用于治疗，也可以作为抗心律不齐的药物。因此也成为心肌负荷试验药物的市场新宠，目前是全球应用最多的心脏负荷试验用药，也是经FDA批准的用于心脏药物负荷试验的两种药物之一。

1.1.4 腺苷的副作用

腺苷的副作用（潮红、气急、胸痛）较常见，但多为一过性（1～2 min内消失）。室上这终止后常见短暂的窦性心动过缓和室性早搏。因此对有窦缓或房室阻滞者慎用。由于腺苷的作用时间短，因此对血流动力学几无影响，较少引起低血压。腺苷与某些药物具有相互作用。治疗浓度的茶碱能阻断腺苷赖以发挥电生理和血流动力学作用的受体。双嘧达莫（潘生丁）阻断腺苷的摄取，从而使其作用增强。对正在服用这些药物的患者，应选用其它药物治疗心律失常。

1.1.5 生产腺苷的微生物菌种

枯草芽孢杆菌GMI-741为出发菌株，通过多因子诱变出具有黄嘌呤缺陷型、丧失腺嘌呤脱氨酶的腺苷产生菌GMI-Xn200（Xan-）。

1.2腺苷的应用

1.2.1药物

腺苷是一种普遍存在于生物体中的物质，是嘌呤核苷酸脱磷后的产物。在人体中是调节细胞生理代谢的一种信号分子。在美国，腺苷是经FDA批准的转复阵发性室上性心动过速（PSVT）的一线药物，也是经FDA批准的用于心脏药物负荷试验的两种药物之一，已经成为急诊处理快速性心律失常和药物负荷试验的常规用药。此外，腺苷还是合成三磷酸腺苷（ATP）和许多抗病毒药物（如阿糖腺苷等）的主要原料。腺苷作为一种多用途的原料药,无论是应用于临床还是作为生产ATP的前体,都具有重要价值。而目前国内腺苷的生产主要是酶法或化学法,成本较高,发酵法生产腺苷鲜有报道,因此有必要研究用发酵法生产腺苷,以降低生产成本。

1.2.2药物中间体

腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张 冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系 统及组织均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺 嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

1.2.3 腺苷生产意义

腺苷是核酸代谢途径中的主要因子之一，是酶反应和细胞修复所修复所需要辅助因子的组成部分，具有广泛的生理和药理作用。其生产意义主要有：（1）临床用药，治疗心率不齐、风湿类心脏病、心肌炎等；（2）抗病毒、肿瘤，以及ATP、CoA等多种药用核苷酸类物质前体。

1.3 腺苷的制备方法

自从1909年首次从苦味酸盐中提取出腺苷后，其合成和应用就得到了广泛的研究。腺苷的合成总的来说可分为生物合成法和化学合成法，生物合成法主要有发酵法和RNA降解法两种，由于发酵法生产腺苷有成本上的优势，因此是今后腺苷生产的发展方向。

1.3.1 发酵法

1937年，Hemut等报道了通过发酵得到核苷酸，再进行酶解得到腺苷；1954年，John等用腺嘌呤和肌苷通过大肠杆菌发酵，用游离细胞法得到了腺苷1965年，奥村用芽孢杆菌为产生菌进行腺苷发酵，生成量为1.1g/L；1968年，小西真八等使用枯草杆菌的异亮氨酸缺陷型在含有异亮氨酸0．03％的培养基中积累1.26g/L的腺苷(最高可达2.45g/L)；1976年，中山清用耐2-氟腺嘌呤的产氨短杆菌ATCC21709在适当的培养基中振荡培养96h，腺苷生成量为2.1g/L；1986年，美国的Howard ML等用酵母菌进行腺苷发酵的研究，产量小于5g/L；用发酵法生产腺苷最成功的是日本的Haneda等，他采用芽孢杆菌P53—18菌株以葡萄糖为原料进行发酵，腺苷最大生成量达16 L。南京工业大学的柏建新研究院通过对核苷酸的研究发现，通过对肌苷产生菌经过ＤＮＡ转化，物理、化学诱变处理，得到的JSIM-Ａ-３是一株与亲株遗传标记不同的新的突变株，为黄嘌呤、组氨酸、硫氨素三重营养缺陷型，缺失腺嘌呤脱氨酶，不产肌苷，只积累腺苷。该新工艺中试发酵水平已经稳定在10g／L以上，发酵液净化提取收率达60%以上。创造了很好的社会效益。

1.3.2 RNA降解法

高核酸酵母制取核糖核酸(RNA)，酶解得到磷酸腺苷，脱磷酸根制取腺苷。这是我国过去采用的生产方法。

RNA(核糖核酸)是生命存在的物质基础，几乎所有的生物体内都含有RNA(某些病毒除外)，从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的微生物菌体中含有丰富的核酸资源，如啤酒酵母、纸浆酵母、石油酵母、糖蜜培养的面包酵母、综合利用生产的白地霉、抗菌素(如青霉素)菌丝体等。系统筛选的某些酵母菌(所谓的高核酸酵母)如白假丝酵母(Candida utilis)、啤酒酵母(Sarcharomyces Cerevisiae)，以糖蜜和醋酸为碳源，培养过程中加入氯化铝或硫酸铝，pH控制在4.5，菌体RNA含量可高达16％以上。

1.3.3 化学合成

化学合成腺苷的方法很多，如：① 由2,8-二氯嘌呤合成腺苷；② 由2-甲基硫代腺苷合成腺苷；③ 由5-胺-4-氰基-1-咪唑-D-核糖呋喃或其衍生物合成腺苷；④ 由8-巯基-9-甲基腺嘌呤合成腺苷；⑤ 由2,3,5-三乙酰基次黄苷合成腺苷。上述方法起始原料价格较贵，难以应用于大规模合成中。由于近几年来，国内肌苷发酵水平大幅度提高，肌苷生产成本已下降到5万元／t左右，因此以肌苷为起始原料进行腺苷的合成目前已进人工业化生产阶段；另外，以肌苷为原料合成抗病毒药物三氮唑核苷(Ribavifin，利巴韦林)时，有大量副产物次黄嘌呤产生，因此，以次黄嘌呤为原料合成腺苷在成本上也是可行的。

1.3.4 由次黄嘌呤合成腺苷

由次黄嘌呤为起始原料合成腺苷时，首先次黄嘌呤与三氯氧磷(POC13)反应制得6一氯嘌呤，6一氯嘌呤再与四乙酰核糖在特制的催化剂作用下发生缩合反应(130-140℃)，生成缩合物6-氯-9-(13-D-2,3,5-三乙酰基呋喃核糖)嘌呤，缩合物在0℃饱和的氨甲醇作用下氨解(100℃，氨解10 h)制得腺苷，3步反应的总收率约为45％。

1.3.5 由肌苷合成腺苷

20年前，肌苷发酵水平很低、价格很高。是由腺苷在亚硝酸作用下脱氨而产生的；而现在情况相反，是以肌苷为起始原料合成腺苷，合成过程主要包括酰化、氯化和氨解3个步骤。酰化主要是为了保护核糖上的3个羟基，一般用肌苷与醋酐一冰醋酸进行乙酰化反应，制成三乙酰肌苷；然后在三氯甲烷中用氯亚叉进行三乙酰肌苷6一羟基的氯化，得到6-氯-9-(β-D-2,3,5-三乙酰基呋喃核糖)嘌呤；最后氨解步骤同由次黄嘌呤合成腺苷的一样。3步反应的总收率约为50％-60％。

1.3.6 酶合成法

早在1938 年,Max等就发现, 通过土豆可得到高产的土豆磷酸酶, 再将其分解可得到腺苷。1955年,Ursula发现纯的腺苷、腺嘌呤可以从叶子中分离出来, 并且在水果及花朵中同样可提取。1971年, Pàces等发现在烟草组织中酶的活性可将N 62(△22异戊基) 腺苷转变成为腺苷, 它可将细胞分裂素转变成为腺苷。1971年,Borgers等研究证明, 在狗、鼠及人体的心肌血管壁上分布着5’-核苷酶, 在其最佳位置与心肌相连的部位可产生腺苷。1975 年, Kluge等发现在兔子的脑中可用ATP合成腺苷, 且这个反应在有Ca² 存在下明显提高。

1.4 腺苷生产菌的特性

根据腺嘌呤核苷酸合成途径“堵与疏”的方法，腺苷生产菌株的基本代谢特性和遗传标记的确定如下图所示:其中II表示途径阻断，t表示途径增强。在下面列出了营养缺陷型(用上标“一”表示)、应该灭活(用上标“一”表示)或活性增强(用“个”表示)的重要的酶。

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