论文总字数：19068字

摘 要

蔗糖广泛分布于植物体内，在工业上已成为生产乙醇、柠檬酸、乳酸等生物基产品的重要原料。丁二酸（琥珀酸）作为一种优秀的C4平台化合物，可被广泛应用于制备药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物。但是目前大多数大肠杆菌不能利用蔗糖生产丁二酸。E.coli BA102为敲除了乳酸脱氢酶的编码基因（ldhA），丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)和磷酸转移酶(ptsG）的三敲除菌株。该菌株可以利用葡萄糖生产丁二酸，但是不能利用蔗糖产丁二酸，为了使BA102具有代谢蔗糖的能力，来自E.coli W中的蔗糖非PTS系统克隆并表达到BA102中。

在本研究过程中,构建了重组菌E.coli BA502，该菌株的主要特征为BA102 表达来自E. coli W的蔗糖通透酶、蔗糖水解酶及果糖激酶基因后，具有蔗糖代谢能力。厌氧摇瓶中，以蔗糖为唯一碳源，72h产了11 g/L丁二酸。在3-L发酵罐中，以蔗糖为唯一碳源，160h产了32g/L丁二酸。

关键词：丁二酸； 蔗糖； 大肠杆菌

Abstract

Sucrose is one of the most abundant disaccharide in the environment because of its origin in higher plant tissues. It has become an important carbon source in the production of ethanol, citric acid, lactic acid and other bio-based products. Succinic acid is an excellent platform C4 compound, which can be widely used in pharmaceutical, fine chemical products as well as the preparation of biodegradable polymer. However, most E. coli can not use sucrose to produce succinic acid. E.coli BA102 is a mutant with lactate dehydrogenase (ldhA), pyruvate - formate lyase (pflB), and phosphotransferase (ptsG) inactivated. This strain can utilize glucose to produce succinic acid, but not sucrose. In order to achieve the ability to metabolize sucrose in BA102, non-PTS sucrose system from E.coli W was cloned and expressed in BA102.

In this study, recombinant bacteria E.coli BA502, the main feature of this strain is BA102 obtaining sucrose permease system from E. coli W with the ability to metabolize sucrose. In anaerobic shake flasks, sucrose as the sole carbon source, in 72h 11 g/L of succinic acid production was produced by BA502. In the 3-L fermentor, sucrose as the sole carbon source, in 160h 32 g/L of succinic acid production was produced by BA502.

Keywords: Succinic acid; Sucrose; E. coli

目 录

摘要 I

Abstract: II

第一章 绪论 1

1.2 丁二酸的性质 1

1.3 丁二酸的应用 2

1.4 丁二酸的生产方法 3

1.4.1化学合成法 3

1.4.2微生物发酵法 4

1.4.3合成方法的比较 4

1.5立题意义 5

1.6 国内外研究现状 7

1.7本课题的研究目标与研究内容 8

1.7.1研究目标 8

1.7.2研究内容 9

第二章 材料和方法 10

2.1 实验材料 10

2.1.1菌株和质粒 10

2.1.2 培养基 10

2.1.3 主要仪器 10

2.1.4主要试剂及配置 11

2.2 实验方法 12

2.2.1 目的基因的扩增与重组 12

2.2.2 菌株保藏 14

2.2.3 厌氧摇瓶发酵 15

2.2.4 发酵罐厌氧发酵 16

2.3 分析方法 16

2.3.1大肠杆菌的发酵以及细胞的生长量测定 16

2.3.2 糖、有机酸及其他次生代谢物质的测定 17

第三章 结果与讨论 18

3.1 重组菌E.coli BA502 的构建 18

3.1.1 PCR 产物鉴定 18

3.1.2 重组质粒单酶切鉴定 18

3.2 厌氧血清瓶发酵验证BA502利用蔗糖的能力 19

3.3 厌氧发酵罐发酵验证BA502利用蔗糖的能力 20

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2展望 21

参考文献 22

致谢 26

第一章 绪论

1.1立题背景

琥珀酸作为一种四碳酸是一种优秀的化学平台产品,能够作为许多重要的中间产物和专业化学制品。作为商品化的化学制品,它可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品^[1−3]。传统的丁二酸生产方法主要是应用石化法从丁烷通过顺式丁烯二酐生产，但随着传统能源煤炭和石油的不断消耗，以及价格的持续攀升，使得以不可再生的战略资源石油产品作为原料的传统琥珀酸生产方法因其导致的高价格和高污染抑制了琥珀酸的发展潜力^[4－7]。因而随着生物工程技术的迅速发展和成熟,生物转化法生产琥珀酸由于其高效率、环保性以及原料的可持续利用性而受到一些研究工作者的推崇。

大肠杆菌是生产工业产物的常用宿主菌，由于其遗传背景清楚、易操作、生长速率快、易培养及利用碳源广等诸多优点，被认为是最有潜力的琥珀酸生产菌株^[8-9]。但大肠杆菌对木糖厌氧发酵形成的产物很复杂,有乳酸、乙酸、和甲酸,而琥珀酸只是产物中很少的一部分，因此随着生物技术的发展，利用遗传工程的手段改造大肠杆菌，并且通过对发酵条件的优化来提高琥珀酸的产率是目前研究的重点。

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