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摘 要

为了降低D-乳酸生产的原料成本，采用农业废弃物玉米芯水解液替代葡萄糖，用棉籽粕替代昂贵的酵母膏来作为发酵的碳氮源。实验表明在初始还原糖浓度为100g/L，棉籽粕3.5g/L，中性蛋白酶0.3g/L，10M NaOH控制pH6.5情况下，采取补料发酵措施，芽孢乳杆菌YBS1-5在90h内产生了111.8g/L的D-乳酸，转化率为0.87g/g 葡萄糖，光学纯度达98%。本文代表了一种利用农业废弃物发酵产D-乳酸的新途径。

关键词：芽孢乳杆菌；D-乳酸；玉米芯；棉籽粕

Efficient production of D-lactic acid from corn cob hydrolyzate by Sporolactobacillus sp.YBS1-5 with cottonseed meal as nitrogen

Abstract

Highly efficient D-lactic acid production by Sporolactobacillus sp.YBS1-5 was demonstrated in this study. Corncob hydrolyzates containing a high content of glucose, which was prepared from corncob, was used as sole carbon source for D-lactic acid production. Cottonseed meal containing a high concentration of nitrogen was enzymatically hydrolyzed and simultaneously utilized as alternative to yeast extract during D-lactic acid fermentation. Under optimal conditions, 110.8 g/L D-lactic acid was obtained in fed-batch fermentation within 90 h, with 1.24 g/L/h average productivity, 87%, and 98% optical purity. This study represents a cost-effective method for D-lactic acid production from cheap agricultural wastes.

Keyword: Sporolactobacillus sp, D-lactic acid, corncob hydrolyzate, cottonseed meal

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 乳酸的结构和性质 1

1.2 D-乳酸的应用 1

1.2.1 D-乳酸在手性物质合成中的应用 1

1.2.2 D-乳酸在聚乳酸上的应用 2

1.3 D-乳酸制备方法 3

1.4 D-乳酸生产的研究进展 3

1.5 本课题研究思路及研究内容 5

第二章 利用玉米芯水解液做碳源棉籽粕同步酶解发酵产D-乳酸的研究 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 菌株 6

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 实验仪器 7

2.1.4 培养基 8

2.1.5 主要溶液及其配制 8

2.1.6 玉米芯水解液的制备 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 平板培养 9

2.2.2 种子培养 9

2.2.3 发酵培养 9

2.2.4 补料发酵 10

2.3 分析方法 10

2.3.1 玉米芯水解液成分的测定 10

2.3.2 酸性纤维素酶活的测定 10

2.3.3 氮源的氮含量的测定 10

2.3.4 中性蛋白酶活的定义 10

2.3.5 生物量的测定 11

2.3.6 残糖含量的测定 11

2.3.7 产物乳酸的定量分析 11

2.3.8 产物乳酸的光学纯度分析 11

2.4 结果与分析 11

2.4.1 玉米芯水解液成分的测定 11

2.4.2 不同氮源的氮含量的测定 11

2.4.3 不同氮源对菌YBS1-5发酵产D-乳酸的影响 11

2.4.4 不同浓度棉籽粕对菌YBS1-5产D-乳酸的影响 12

2.4.5 不同浓度中性蛋白酶水解棉籽粕对YBS1-5发酵产D-乳酸的影响 13

2.4.6 补料发酵 14

第三章 结论与展望 15

3.1 结论 15

3.2 展望 15

参考文献 16

致谢 18

第一章 文献综述

1.1 乳酸的结构和性质

乳酸（Lactic acid, 简称LA），又名2-羟基丙酸、α-羟基丙酸或丙醇酸，化学式C₃H₆O₃，分子量90.08，是自然界广泛分布的三大有机有机酸之一^[1,2]。由于乳酸分子中存在一个不对称碳原子，因此可以将乳酸分为L( )-乳酸和D(-)-乳酸，其结构如图1-1所示。虽然自然界普遍存在的是L-乳酸^[3]，但是L-乳酸和D-乳酸互为镜像，不能重叠，均为手性物质，除旋光性外其余理化性质都相同。在D-乳酸的结构中由于同时存在一个α-羧基和一个α-羟基，因此其可参与氧化还原反应、缩合反应和酯化反应等，并且其可以脱水可形成聚乳酸^[4]。另外，D-乳酸在加热的条件下非常易于进行自身的酯化反应，脱水形成乳酰乳酸C₆H₁₀O₅，稀释并加热后又可再生成D-乳酸。

图 1-1 乳酸的两种异构体结构式

Fig. 1-1 Structure of D(-) and L( ) isomers of the lactic acid

1.2 D-乳酸的应用

1.2.1 D-乳酸在手性物质合成中的应用

D-乳酸是自然界现存的最小手性物质，是多种手性化学物合成的前体，目前已广泛应用于医药、高效低毒除农药及化工等领域的手性合成。在医药方面，以D-乳酸为原料可以合成R-1,2-丙二醇、R-2-羟基羧酸酯等，而这些化合物是合成多种手性药物的中间体^[5,6]。在高效低毒除草剂方面，目前已经有多个以D-乳酸为合成基础的旋光性除草剂上市。比如德国赫司特公司已经成功开发了以D-乳酸为原料的新型芳氧丙酸类除草剂——威霸（Whip Super），其效果比以L-乳酸为原料合成的除草剂高6-12倍^[7]。日本达伊赛尔化学工业公司利用自产的高光学纯度D-乳酸（光学纯度97%以上）为原料生产禾本科杂草除草剂—骠马(PumaSuper)。这种除草剂不仅高效低毒而且其残留物在土壤中可以快速降解^[8]。德国巴斯夫公司以 D-乳酸异丙酯为原料成功生产处高效除草剂 Duplosan ，已经大规模投放市^[8]。而D-乳酸甲酯C₄H₈0₃在化工上也具有重要的应用，由于其具有熔点高、蒸发速度慢、可与多种极性溶剂均匀混合的优点，能充分溶解硝化纤维素、醋酸纤维素、乙酰丁酸纤维素等以及多种极性合成高分子聚合物，因此是一种优秀的高沸点溶剂，并且D-乳酸甲酯做为混合溶剂的成分，能改善做业性和增溶性^[9]。

1.2.2 D-乳酸在聚乳酸上的应用

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