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摘 要

鼠李糖脂是一种重要的生物表面活性剂，能够显著降低界面张力，具有良好的乳化性能，毒性小、易于生物降解，因而在石油开采、医药、食品、日化及环境保护等许多领域具有极大的应用潜力。目前，产量低限制了鼠李糖脂在工业上的广泛应用，采用有效的方法选育出鼠李糖脂高产菌，可有效推广鼠李糖脂在工业上的应用。

利用ARTP生物育种机对铜绿假单胞菌进行诱变选育，获得了一株遗传性状稳定的高产突变株，其产量是出发菌株的1.7倍。然后通过单因素及响应面分析法，对该高突变株进行产鼠李糖脂条件的优化。优化后的培养基组分为：花生粕 13.2 g/L，NaNO₃ 3.5 g/L，甘油 40 mL/L，菜籽油10 mL/L， KH₂PO₄ 1 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1 g/L，MgSO₄0.1 g/L，FeSO₄•7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂•2H₂O 0.1 g/L。优化后的培养条件：摇床转速200 r/min，250 mL三角瓶中装液量50 mL，接种量6.0 %，培养温度35 ℃，初始pH为6.5。采用优化后的培养基及培养条件进行发酵，发酵120 h后，鼠李糖脂产量达到40 g/L。

采用有机溶剂萃取法提取出表面活性剂，接着对产物进行质谱分析和薄层色谱分析。结果表明该表面活性剂主要为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。

关键词：常压室温等离子诱变；鼠李糖脂；铜绿假单胞菌；响应面法

High yield bacteria ARTP mutagenic breeding of surfactant

ABSTRACT

Rhamnolipid is a kind of important biological surface active agent，it can significantly reduce the interfacial tension, good emulsifying properties, low toxicity and biodegradability. So it has great potential applications in many fields of oil exploitation, pharmaceutical, food, daily chemical and environmental protection and so on. Now，low yield of rhamnolipid limits its wide use in industry. Selection of high-yield rhamnolipid producing strain by an effective method can be used effectively promote the rhamnolipid in industry.

In order to obtain an industrial stain with higher rhamnolipid yield,the original stain of Pseudomonas aeruginosa S-3 was mutated by atmospheric and room temperature plasmas.A good genetic stability strain B-11was screened from the mutants, whose rhamnolipid production was 1.7 times the original strain.The medium components for the production of protease were optimized by single factor experiment. The optimized medium consisted: peanut meal13.2 g/L，NaNO₃ 3.5 g/L，glycerin 40 mL/L，colza oil 10 mL/L，KH₂PO₄ 1 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，FeSO₄•7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂•2H₂O 0.1 g/L. Optimized culture conditions were: initial pH6.5,incoculation size 6 %(V/V），cultivations were conducted in 50 mL of medium in 250 mL Erlenmeyer flasks incubated at 35 ºC. Using the optimal medium compositions and culture condition above, and after 120 h of fermentation, the yield of rhamnolipid reached to 40 g/L.

Using organic solvent extraction method to extract the surfactant and the product mass spectrometry and TLC analysis.Results show that the surfactant is mainly for single rat lee glycolipids and double rat lee glycolipids.

Key Words：Atmospheric and room temperature plasmas（ARTP）；Rhamnolipid；The response surface method；Pseudomonas aeruginosa

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 表面活性剂 1

1.1.1 表面活性剂定义 1

1.2 鼠李糖脂化学性质 1

1.3 制备方法 2

1.4 生物学特性 2

1.4.1 天然性 2

1.4.2 生物降解性 3

1.4.3 非基因修饰或非基因工程 3

1.5鼠李糖脂的应用 3

1.5.1 重金属土壤修复 3

1.5.2 抗菌性 3

1.5.3 生物堆肥 4

1.5.4 生物采油 4

1.6 ARTP仪器简介 4

第二章 ARTP诱变选育表面活性剂高产菌 6

2.1 实验材料 6

2.1.1试剂 6

2.1.2 主要仪器设备 7

2.2 实验方法 7

2.2.1菌株和培养基 7

2.2.2 菌种保藏 7

2.2.3 菌种的活化 8

2.2.4 ARTP诱变方法 8

2.2.5 菌种筛选方法 8

2.2.6 鼠李糖脂含量检测方法 9

2.3 实验结果与讨论 9

2.3.1等离子体处理时间对Pseudomonas aeruginosa S-3的致死率 9

2.3.2 ARTP诱变选育鼠李糖脂高产突变株 10

2.4 本章小结 10

第三章 铜绿假单胞菌产鼠李糖脂培养基及其条件优化 12

3.1 实验材料 12

3.1.1 实验试剂 12

3.1.2 实验仪器 12

3.2 实验方法 12

3.2.1 菌种和培养基 12

3.2.2 产鼠李糖脂条件与方法 13

3.2.3菌体浓度测定 13

3.2.4鼠李糖脂含量的测定方法 13

3.2.5 发酵培养基对产鼠李糖脂的影响 13

3.2.6 发酵条件对产鼠李糖脂的影响 14

3.3结果与讨论 15

3.3.1 发酵培养基对产鼠李糖脂的影响 15

3.3.2 发酵条件对产鼠李糖脂的影响 19

3.4 本章小结 22

第四章 表面活性剂鼠李糖脂的分离提取 23

4.1 实验材料 23

4.1.1 实验试剂 23

4.1.2 实验仪器 23

4.2 实验方法 23

4.2.1鼠李糖脂的提取 23

4.2.2 TLC（薄层层析）法糖脂定性分析 23

4.2.3 质谱分析 24

4.3 结果与讨论 24

4.3.2 质谱分析 25

4.4 本章小结 26

第五章 结论与展望 27

5.1 结论 27

5.2 展望 27

参考文献 28

致谢 30

第一章 文献综述

1.1 表面活性剂

1.1.1 表面活性剂定义

生物表面活性剂是利用酶或微生物等通过生物催化和生物合成等生物技术从微生物、植物和动物上得到的集亲水和憎水基结构于一体的具有高表面活性的天然表面活性剂^[1]，其结构多样，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中性类脂衍生物等。同一般化学表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有显著降低表面张力、稳定乳状液、较低临界胶束浓度等特点外^[2] , 还无毒或低毒; 良好的选择性、专一性及生物相容性; 结构多样性; 具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤等药理作用和免疫功能；可生物降解, 对环境友好;可由工业废料生产, 利于环境治理等特性^[3-4]。所以，其在医药、化妆品、洗涤剂和食品等工业方面具有潜在的应用价值，并且在难降解有机化合物如PAH、PCBs、石油烃的修复中，也具有重要作用^[5-8]。鼠李糖脂是生物表面活性剂中研究比较深入的一类，属于糖脂类，是一种非离子型生物表面活性剂，不仅具有降低油水界面/界面张力、乳化、增溶和改变分子极性等功能，而且其毒性小、易于生物降解。

1.2 鼠李糖脂化学性质

鼠李糖脂是由亲水基和疏水基组成，亲水基由1-2分子鼠李糖环构成，疏水基由1-2分子具有不同碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸构成。在生物合成过程中，这些基团之间可能相互链接而生成多种化学结构相近的同系物。研究表明，发酵产物中一般含有4种主要的鼠李糖脂，它们分别是 RL1(Rha₂C_l0C_l0)，RL2 (RhaC_l0 C_l0)，RL3 (Rha₂C_l0)和 RL4(RhaC₁₀)其中，Rha₂C_l0C_l0化学名为2-0-α-L-吡喃鼠李糖苷 -β-羟基癸酰 -β-羟基癸酸，又称双鼠李糖脂；RhaC_l0 C_l0为α-L-吡喃鼠李糖苷-β-羟基癸酰 -β-羟基癸酸，又称单鼠李糖脂。单鼠李糖脂只含有一个鼠李糖环，化学式为C₂₆H₂₈O_9，双鼠李糖脂含两个鼠李糖环，化学式为C₃₂H₅₈0_13。

图1 鼠李糖脂的化学结构通式^[9]

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