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摘 要

利用廉价、储量丰富的木质纤维素类生物质生产液体燃料，对于解决当前能源危机和环境问题具有重大意义。木质纤维原料经预处理和水解后会产生大量的葡萄糖和木糖，其中木糖比重最高可达 20%，然而自然界中的微生物普遍不能以木糖作为发酵底物，这一问题已成为发展木质纤维原料生物炼制的主要瓶颈。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是当前氨基酸和核酸工业的主要生产菌株，在细胞生长停滞的状态下，仍能大量合成乳酸、琥珀酸等高附加值产物，且对木质纤维原料预处理过程中产生的抑制物具有良好的耐受性，但目前分离出的谷氨酸棒杆菌都由于缺失木糖异构酶的编码基因 xylA 而不能代谢木糖。由此，本论文拟通过基因工程手段，将大肠杆菌 MG1655 的 xylA 基因导入谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032 菌株中进行表达，从而构建谷氨酸棒杆菌木糖代谢工程菌。

关键词：谷氨酸棒杆菌 木糖利用 代谢工程 基因表达

ABSTRACT

Liqudid Biofuel from lignocellulosic biomass is an efficient approach to resolve the recent energy crisis and environment problems. Lignocellulosic hydrolysates contain not only glucose as major component, but also a significant fraction of xylose (up to 20%), however few wild-type strains in nature can utilize xylose as a fermentable substrate. This problem has constituted a major bottleneck to the implementation of lignocellulosics biorefinery. Corynebacterium glutamicum is widely used in amino acid and nucleotide industrial production. It can produce significant value-added commodities and shows remarkable resistance towards lignocellulose-derived inhibitors under growth arrested conditions. But none of the C.glutamicum so far isolated were reported to utilize xylose due to the absence of gene xylA encoding xylose isomerase. The research work in this paper is to genetically engineered a xylose metabolic pathway in C.glutamicum ATCC 13032 by expressing the xylA gene from Escherichia coli MG1655.

Key words: Corynebacterium glutamicum, Xylose utilization, Metabolic engineering, Gene expression

目录

摘要 II

ABSTRACT III

目录 IV

第1章 绪论 1

1.1 木糖转运和代谢途径 1

1.2 通过导入xylA和xylB基因构建谷氨酸棒杆菌木糖代谢工程菌 1

1.3 通过导入xyl1基因构建谷氨酸棒杆菌木糖代谢工程菌 2

1.4 谷氨酸棒杆菌工程菌代谢木糖能力的优化 3

1.5 本文的研究目的和研究内容 4

1.5.1 本文的研究目的 4

1.5.2 本文的研究内容 4

第2章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.2.1 实验仪器 5

2.2.2 实验试剂 6

2.2.3 菌株与质粒 7

2.2.4 培养基及培养条件 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 基因工程操作方法 8

2.2.2 主要的分析方法 9

第3章 结果与讨论 11

3.1 载体与工程菌构建 11

3.2 木糖异构酶酶活测定 12

第4章 结论与展望 13

参考文献 14

致谢 20

第1章 绪论

1.1 木糖转运和代谢途径

细菌主要通过磷酸烯醇式丙酮酸糖转运系统从胞外摄取葡萄糖、甘露糖等己糖，与之不同的是，木糖、阿拉伯糖等戊糖的运输则依靠ABC型运输载体（ATP binding cassette transporters）完成，此外还存在质子协同运输载体（proton-linked transporters）参与戊糖的转运。大肠杆菌是自然界中为数不多的具有木糖代谢途径的细菌，其木糖转运系统包括XylH（木糖透性酶）、XylF（细胞周质木糖结合蛋白）、XylG（ATP结合蛋白）和XylE（质子协同转运蛋白）。相较于ABC型转运蛋白，H -Symporter与底物的亲和力较弱，原因是前者具有更复杂的构型，未来可在这一方面通过基因工程加以修饰从而提高细菌的戊糖转运水平。

细菌主要的木糖代谢途径包含以下两步：木糖首先在木糖异构酶（xylose isomerase，XylA，简称XI）作用下转化为木酮糖，然后再通过木酮糖激酶（xylulokinase，XylB，简称XK）磷酸化形成磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）中间体5-磷酸-木酮糖。目前分离出的谷氨酸棒杆菌普遍不能代谢木糖，原因是该菌株缺失木糖异构酶的编码基因。在已完成全基因组测序和注释的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和谷氨酸棒杆菌R菌株中，有若干蛋白质编码序列与大肠杆菌编码木糖转运蛋白的基因存在较高同源性，研究结果表明这两个菌株都能够从胞外摄取木糖，但具体的转运机制尚未明确。此外，它们有一内源性基因的编码产物在功能上与XylB相同，该基因的表达量在木糖诱导作用下可提高9倍，这表明谷氨酸棒杆菌中可能存在木糖特异性调控基因。

1.2 通过导入xylA和xylB基因构建谷氨酸棒杆菌木糖代谢工程菌

Kawaguchi等利用高拷贝穿梭载体将大肠杆菌K-12菌株木糖操纵子中的xylA和xylB基因导入谷氨酸棒杆菌R菌株，在组成型启动子trc（来源于质粒pTrc99A）下进行表达，成功构建了能够有效利用木糖的谷氨酸棒杆菌工程菌。重组菌株CRX2能以木糖为唯一碳源进行生长，但生长速率（0.20/h）略低于在相同浓度（20g/L）的葡萄糖培养基中（0.28/h）。在含木糖（3.6g/L）和葡萄糖（3.6g/L）的混合培养基中，CRX2能将两种碳源全部利用，生长过程中没有出现二次生长现象，但对木糖的代谢水平要低于葡萄糖，其消耗两种碳源的最大速率分别为1.5 mmol·h^-1 g^-1细胞干重（木糖）和2.8 mmol·h^-1 g^-1细胞干重（葡萄糖），且当培养基中葡萄糖被完全利用后，重组菌株代谢木糖的速率明显加快。此外，在木糖培养基中预培养的CRX2消耗木糖的速率是在葡萄糖培养基中预培养菌株的1.4倍。

由于xylA和xylB基因都是组成型表达，且检测到的相应酶活远高于同化木糖实际所需的水平，上述实验结果的出现可能是由于葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的木糖转运系统以及木糖异构酶-木酮糖激酶下游代谢途径存在一定程度的阻遏作用。这样的调控机制就存在于大肠杆菌中，在木糖培养基中生长的E. coli，其编码木糖转运蛋白和丙酮酸激酶基因的转录水平明显高于在葡萄糖培养基中生长的菌株。

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