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毕业论文网 > 毕业论文 > 化学化工与生命科学类 > 生物工程 > 正文

白色念珠菌来源醛酮还原酶全细胞催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究毕业论文

 2022-06-05 22:15:02  

论文总字数:20580字

摘 要

(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯是非常重要的合成许多药物的手性中间体。例如,它可以用于合成(R)-4-氰基-3羟基丁酸乙酯、L-肉毒碱[1]、大环内脂A等等,也能转化为负霉素[2](negamycin)和2,5-环己烯合成纤维[3]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作为潜手性底物的酶催化法制备(R)-CHBE由于其具有诸多优势,是目前首选的制备方式。

将醛酮还原酶CAK和葡萄糖脱氢酶BmGDH在大肠杆菌中共表达,添加辅底物葡萄糖实现辅酶循环催化体系。在单一水相体系中,利用共表达重组菌全细胞并添加辅底物葡萄糖构建双酶偶联催化体系。研究温度、pH、底物COBE浓度、菌体浓度,辅底物葡萄糖浓度这五个基本的催化条件对单一水相全细胞转化COBE反应的影响。在合适的转化条件下(30℃,pH=7.0,菌体浓度75g/L,辅底物于底物摩尔比是1.25:1),转化100g/L的底物COBE,反应30h产率达到约67.31%,光学纯度e.e.值大于99%。

关键词:全细胞催化 醛酮还原酶 辅酶循环

Candida albicans whole cell source AKR catalytic synthesis of (R) -4- chloro-3-hydroxybutyrate

Abstract

(R)-4-chloro-3-hydroxybutyrate is very important to many drugs chiral synthetic intermediates. For example, it can be used for the synthesis of (R)-4- cyano-3-hydroxybutyrate, L- carnitine, etc. A macrolide, rapamycin can also be converted to negative (negamycin) and 2, 5- cyclohexene synthetic fibers.With ethyl 4-chloroacetoacetate (COBE) prepared as a latent chiral substrate enzyme-catalyzed SYSTEM (R) -CHBE Because of its many advantages, it is now the preferred mode of preparation.

The CAK and glucose dehydrogenase BmGDH co-expressed in E. coli, add auxiliary substrate glucose circulating catalyst system to achieve coenzyme.Single aqueous system, use whole-cell co-expressing recombinant strain and add a secondary substrate glucose to build dual enzyme conjugate catalytic system. Temperature, pH, substrate COBE concentration, cell concentration of these four basic catalytic conditions affect the whole cell transformation phase COBE respond to a single water. At (30 ℃, pH = 7.0, cell concentration of 75g / L, the auxiliary substrate to substrate ratio is 1.25: 1) the appropriate conversion conditions, the conversion 100g / L substrate COBE, the reaction yield of about 30h 67.31%, optical purity ee of greater than 99%.

Key words: whole cell catalysis aldo-keto reductase Coenzyme cycle

目 录

摘要 1

Abstract 2

第一章 绪论 5

1.1 手性化合物的意义 5

1.2 制备手性化合物的主要方法 5

1.2.1 手性源诱导合成法 5

1.2.2 外消旋体拆分 6

1.2.3 不对称合成法 6

1.3生物催化法制备手性化合物 6

1.3.1生物催化的概念 6

1.3.2生物催化应用于手性化合物的研究进展 7

1.3.3利用完整细胞进行生物催化的形式 7

1.3.4生物催化的特点 7

1.4 制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究进展 8

1.4.1 4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)的概况 8

1.4.2 R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法 8

1.4.3 生物催化合成(R)-CHBE的研究进展 8

1.5 辅酶再生策略 9

1.5.1 酶偶联的辅酶循环系统 9

1.5.2 底物偶联的辅酶循环系统 10

1.6 本课题的研究意义 11

1.7 本课题的研究内容 11

第二章 构建双酶偶联的辅酶循环体系 12

2.1 前言 12

2.2 材料与方法 12

2.2.1 实验仪器 12

2.2.2 实验试剂 12

2.2.3 工具酶及试剂盒 13

2.2.4 菌株与质粒 13

2.2.5 培养基及培养方法 14

2.2.6 设计引物以及GDH基因的克隆 14

2.2.7 双酶共表达重组质粒的构建和验证 15

2.2.8 重组质粒转化大肠杆菌 16

2.2.9 目的蛋白的表达及酶活的测定 16

2.3 结果与讨论 18

2.3.1 葡萄糖脱氢酶GDH基因片段的扩增 18

2.3.2 重组质粒pET-22b-CAK-BmGDH的构建及鉴定 19

2.4 本章小结 20

第三章 全细胞双酶偶联体系催化制备(R)-CHBE 21

3.1 前言 21

3.2 实验材料 21

3.2.1 实验仪器 21

3.2.2 实验试剂 21

3.2.3 水相催化制备(R)-CHBE 23

3.2.4 气相色谱定量分析方法 23

3.3 实验结果 25

3.3.1 pH对反应的影响 25

3.3.2 温度对反应的影响 26

3.3.3 底物浓度对反应的影响 26

3.3.4 细胞浓度对反应的影响 27

3.3.5 辅底物葡萄糖浓度对转化反应的影响 27

3.4 本章小结 27

第四章 结论 29

参考文献 30

致谢 32

第一章 绪论

1.1 手性化合物的意义

手性化合物广泛存在于自然界和生物体中。生命活动基础而又重要的生物大分子往往都是手性化合物,它们在生物体内具有重要的生理功能。

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