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摘 要

富马酸(Fumaric acid)，又称延胡索酸，是一种重要的四碳平台化合物。市场上所售的富马酸主要通过石化法获得，随着石油资源的不断消耗和价格的持续波动，以及化学法制备过程所产生的环境污染等原因，富马酸产业的可持续发展面临严峻的挑战。微生物发酵法生产富马酸由于原料可再生，过程温和，环境污染小而越来越受到人们的关注。

本研究拟采用培养条件简单、遗传背景清晰的大肠杆菌作为富马酸的生产菌株。但原始的大肠杆菌虽然具有富马酸的代谢途径，一般不积累富马酸，要提高其产富马酸的能力，需对现有菌株进行基因改造。本研究在同时敲除fumarate reductase subunit（frdABCD）， lactate dehydrogenase A(ldhA)，alcohol dehydrogenase(adhE)的基础上，设计与目标靶基因相匹配的sRNA干扰靶基因的表达，并构建组合有两个靶基因的sRNA-sRNA体系，实现同时对宿主菌中2个靶基因表达调控的干扰，富马酸的产量由0.33 g/L提高至1.17g/L。本研究工作为构建高效的大肠杆菌富马酸基因工程菌奠定了基础。

关键词：富马酸 大肠杆菌 sRNA 抑制

Construction of the Escherichia coli genetically engineered bacteria which produce fumaric acid-based on sRNA interference

Abstract

Fumaric acid is a four-carbon dicarboxylic acid , it is commonly used as a food acidulant and beverage ingredient. Today most of fumaric acid is produced through petrochemical method. As the continuous rise of petroleum prices and the increasing concern about food and dairy safety, as well as the low-carbon economy, fumaric acid production by microbial is considered to be the most promising option to address these problems.

This study uses a simple culture conditions, a clear genetic background of Escherichia coli as a production strain. Though the natural Escherichia coli has the metabolic pathway of fumaric acid, but it generally do not accumulate fumaric acid. In order to increase its production capacity, we need to modify the strains with genetic engineering methods. This study is based on the knockout of fumarate reductase subunit（frdABCD）， lactate dehydrogenase A (ldhA)，alcohol dehydrogenase (adhE), designed a matched sRNA target gene to interfere the expression of the target gene and construct a sRNA - sRNA systems of two combined target gene, simultaneous interference to host bacteria 2 target gene expression and regulation, fumaric acid production was improved from 0.33 g / L to 1.17 g/L. This work builds the foundation for the yield of reconstructing genetically engineered bacteria E. coli for accumulating fumarate.

Key Words: fumaric acid , Escherichia coli, Small RNA (sRNA), repression

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 富马酸简介（理化性质） 1

1.1.1 富马酸应用 2

1.1.2 富马酸的消费市场 2

1.2 基因工程菌产富马酸的研究进展 6

1.2.1 微生物发酵技术 4

1.2.2 Small regulatory RNA(sRNA) 沉默靶基因技术 5

1.3 本项目的研究思路及意义 6

第二章 实验仪器、材料与方法 7

2.1 实验仪器 7

2.2 实验材料 7

2.2.1 质粒与菌种 7

2.2.2 培养基配方 8

2.2.3 培养条件 8

2.3 实验方法 8

2.3.1 sRNA干扰靶基因表达方法总述 9

2.3.2 引物设计 9

2.3.3 聚合酶链式反应（PCR） 9

2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 10

2.3.5 大肠杆菌MG1655感受态细胞制备方法 11

2.3.6 外源DNA和质粒的导入及转化方法 11

2.3.7 好氧发酵培养 11

2.3.8 有机酸产量检测方法 12

2.3.9 菌种保藏方法 12

第三章 实验结果与讨论 14

3.1沉默单基因对大肠杆菌产富马酸的影响 15

3.1.1 sRNAs PCR片段的制备 15

3.1.2 anti-mgsA、pta、pflB、ackA、poxB sRNAs载体构建及验证 16

3.1.3 发酵结果分析 17

3.2同时沉默基因mgsA和pta对大肠杆菌产富马酸的影响 18

3.2.1 Anti-mgsA-pta sRNAs载体构建及验证 18

3.2.2 发酵结果分析 19

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 24

第一章 文献综述

1.1 富马酸简介（理化性质）

富马酸（fumaric acid），又名延胡索酸、紫堇酸或地衣酸，即反丁烯二酸（IUPAC名为(E)-丁烯二酸），是一种无色、易燃的晶体，由丁烯衍生出的羧酸。它的分子式C₄H₄O₄，分子量116.07，结构如图1-1所示。富马酸在常温常压下为白色结晶粉末，熔点：300～302℃（封管），在165℃（17毫米汞柱）升华。熔点：299～300℃，相对密度：1.635（20/4℃）。溶解性：溶于水，微溶于冷水、乙醚、苯，易溶于热水，溶于乙醇。反丁烯二酸的化学性质与顺丁烯二酸相似。富马酸在水中不同温度下的溶解度如表1-1所示，可以看出其溶解度随着温度的升高而增大。不同的富马酸盐具有不同的溶解度（见表1-2），富马酸钠易溶于水，富马酸钙难溶于水。富马酸在水中的解离常数如下：PK₁=3.02，PK₂=4.38，PKI=3.70^[1-2]。

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