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摘 要

萤火虫荧光素酶广泛应用于食品和医药的若干领域。现如今商品化的荧光素酶分为两种：一种是从自然界的萤火虫体内提取的酶；另一种是将该蛋白合成的相关基因导入大肠杆菌，利用发酵的方法进行荧光素酶的生产。本实验是对菌产荧光素酶的发酵时间、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时OD等表达条件进行了优化，并对荧光素酶的纯化和浓缩方法、反应条件等进行了探索。实验结果表明在37℃，200r/min培养至OD达到1.2—1.8之间加入终浓度为1.0mM的IPTG并且将温度调为30摄氏度诱导7h的条件下，荧光素酶的表达量较高，蛋白浓度达0.054g/L，比酶活为8.7×10⁷ RLU/μg，蛋白纯度90%。与商业化的荧光素酶进行比较，发现本产品的热稳定性以及对于不同pH耐受的广谱性较好。

关键词：荧光素酶 表达条件 三磷酸腺苷 大肠杆菌

Production conditions Optimization of Luciferase

ABSTRACT

Firefly luciferase is widely used in a number of areas of food testing and medicine. Now the commercialization luciferase was divided into two types:The one enzyme is extracted from the nature firefly in vivo;The other one is the protein synthesis associated genes get into E. Coli and luciferase is production by fermentation methods.The experiment is a exploration with the fermentation time, inducer concentration, induction temperature, induction OD of bacterium producing luciferase as well as concentration method and reaction conditions.Experimental results show that at 37 ℃, 200r / min until the culture reached OD between 1.2-1.8 added IPTG 1.0mM final concentration and the temperature was adjusted to 30 ° C under conditions inducing 7h could get high expression of luciferase.Then protein concentration get 0.054g / L, the specific activity achieve 8.7 × 10⁷ RLU / μg, and protein purity of 90%.And compared with commercialization luciferase,the thermal stability of the product as well as for a broad spectrum of different pH tolerance better.

KEYWORDS: Luciferase；Production conditions；adenosine triphosphate；Luciola Mingrelica

摘 要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2 荧光素酶的基本特性 1

1.2.1 荧光素酶结构 1

1.2.2 荧光素酶的研究历史 2

1.2.3 发光原理反应 3

1.3 检测方法 3

1.4 荧光素酶的应用 3

1.4.1病原微生物的快速检测方面 4

1.4.2基因组序列的测定和分析技术中的应用 4

1.5 本课题研究的目的和意义 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 材料与仪器 5

2.1.1 实验材料 5

2.1.2 实验试剂 5

2.1.3 实验仪器 5

2.2培养基的配制 6

2.3 反应液的配置 7

2.4荧光素酶活性检测 7

2.5荧光素酶的表达 7

2.6蛋白纯化以及浓缩方法 7

2.7蛋白含量测定 8

第三章 实验结果及分析 10

3.1 培养基的优化 10

3.1.1碳源的优化 10

3.1.2氮源的优化 10

3.1.3镁离子浓度的优化 11

3.2 发酵条件的优化 12

3.2.1诱导时间的优化 12

3.2.2诱导剂终浓度的优化 12

3.2.3诱导温度的优化 13

3.2.4诱导OD的优化 13

3.2.5 最优条件下的比酶活及蛋白电泳图 14

3.3 酶学性质的探索 15

3.3.1 ATP浓度与酶活关系 15

3.3.2 pH 对于酶活的影响 16

3.3.3 温度对于酶活的影响 16

第四章 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致 谢 21

第一章 文献综述

1.1前言

荧光素酶是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(fireflyaldehyde)氧化发光的一类酶的总称。它源于自然界能够发光的生物的产能。根据来源，荧光素酶被分为萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase,FL)和细菌荧光素酶(bacterialluciferase,BL)。从不同地区的萤火虫提取的FL和从不同细菌中提取的BL分子量大小不同，FL的范围在60～64kD之间，BL的范围在77～79kD之间^[1]。荧火虫荧光素酶是由单一的多肽链组成，而且从不同种类的萤火虫提取的萤火虫荧光素酶的相对分子质量和结构皆不同。从北美萤火虫体内提取的荧光素酶相对分子质量约为62×10³， 是由551个氨基酸残基构成的含有大量疏水氨基酸残基的单一多肽链，而从日本萤火虫体内提取的荧光素酶的相对分子质量约为61×10³，含有548个氨基酸残基^[2]。研究发现细菌荧光素酶是由α、β2个多肽亚基组成的异源二聚体，其相对分子质量约为79×10³。α亚基的相对分子质量约为40×10³，β亚基的相对分子质量约为37×10³。细菌荧光素酶反应的催化位点和底物结合位点都位于α亚基上，β亚基对这个活性结合是必需的，但β亚基的具体作用现在还未知^[2]。

1.2 荧光素酶的基本特性

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