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摘 要

碱性蛋白酶作为在工业、农业、食品、环保等方面重要的酶类，目前的研究重点在于寻找具有高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型蛋白酶。浩瀚的海洋以其独特和多样的生态环境，形成了有别于其它环境的独特而丰富的海洋微生物资源，并产生种类繁多的具有独特结构和功能的生物活性物质，因此，从海洋微生物中寻找特异活性的碱性蛋白酶是一个值得研究的课题。本实验是主要研究的是碱性蛋白酶细菌发酵条件的优化。从采集的海水中提取碱性蛋白酶菌株，首先把菌株分离纯化，通过观察菌株的生长后，测定水解圈直径（d）和菌落直径（D）的比值来进行产碱性蛋白酶细菌的初筛，经过几天的观察后，利用酶活力的测定来进行产碱性蛋白酶细菌的复筛。将筛选后的菌株进行发酵，选出生长良好的菌株后，进行单因素实验，利用Folin-酚测定酶活力。单因素分别为pH、温度、反应时间、装液量 。在不同条件下，利用酶活力不同对菌株的发酵条件进行优化。

关键词：碱性蛋白酶；筛选；海泥；菌株；单因素

Optimizing fermentation conditions of Alkaline protease bacteria

Abstract

As a sort of important enzymes in industries such as agricultural, food, environmental protection and so on, the present study of alkaline protease is focused on looking for high yield, high efficiency, high temperature resistance and high alkali resistance of four high properties protease. For the unique and diverse ecological environment of the vast sea, it has formed unique and rich marine microbial resources which are different from other environment, and produced a variety of special structure and function of bioactive substances. Therefore, looking for a specific activity of alkaline protease from marine microorganisms is a valuable topic. This experiment mainly studies the optimizing fermentation conditions of alkaline protease bacteria. Alkaline protease is extracted from the collection of sea water. First of all, the separation and purification of the strain, then set out the ratio of hydrolysis circle diameter (d) and colony diameter (D) by the observation of growth strain, we can firstly screen bacteria which can produce alkaline protease according to the ratio. After a few days of observation, we made a secondary screening by determination of enzyme activity. After the screening of strains for fermentation, well-growed strain was collected. Single factor experiment, enzyme activity was determined by Folin phenol. Single factor experiment contained pH, temperature, reaction time, the volume of liquid. Through the different conditions, enzyme activity of different optimized.

Key Words :Alkaline protease; Screening; Mud; Bacterial strain; Single factor

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1碱性蛋白酶的介绍、理化性质、生产状况、优化及应用前景 1

1.1.1碱性蛋白酶介绍 1

1.1.2理化性质 1

1.1.3生产状况 1

1.1.4应用前景 2

第二章 实验方法和材料 4

2.1实验方法 4

2.1.1 取样 4

2.1.2 菌株的分离纯化 4

2.1.3 产碱性蛋白酶细菌的初筛 4

2.1.4 产碱性蛋白酶细菌的复筛 4

2.1.5 培养条件对菌株产酶能力的影响 5

2.2实验材料 5

2.2.1材料 5

2.2.2实验器材 6

第三章 实验结果 7

3.1菌株的分离纯化 7

3.2产碱性蛋白酶细菌的初筛 8

3.3 产碱性蛋白酶细菌的复筛 10

3.3.1标准曲线的制作 10

3.3.2产酶菌株的复筛 11

3.4 培养条件对菌株产酶能力的影响 12

3.4.1培养基起始pH值对菌株产酶能力的影响 12

3.4.2培养时间对菌株发酵产酶的影响 12

3.4.3装液量对菌株发酵产酶的影响 13

3.4.4培养温度对菌株产酶能力的影响 13

第四章 分析与讨论 14

4.1培养基起始pH值对菌株产酶能力的影响 14

4.2培养时间对菌株发酵产酶的影响 15

4.3装液量对菌株发酵产酶的影响 16

4.4培养温度对菌株发酵产酶的影响 17

第五章 结论与展望 18

5.1结论 18

5.2展望 18

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

1.1碱性蛋白酶的介绍、理化性质、生产状况、优化及应用前景

1.1.1碱性蛋白酶介绍

蛋白酶因其催化其他蛋白质的肽键，所以是在生理和商业有广泛应用的酶类。在所有的不同的商业用酶中，微生物蛋白酶在全球工业酶制剂的销售额中占有60%的比例。这是因为他们应用于工业领域中的多种行业，比如洗涤剂、食品、制药、化工、皮革、造纸和丝绸工业等。蛋白酶可以根据最佳活力在不同pH范围内分为酸性蛋白酶，中性蛋白酶以及碱性蛋白酶^[1]。最早在猪胰脏中发现的碱性蛋白酶，是一种能够在碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶，并因其在pH呈碱性的条件下的活性和稳定性而应用于许多领域。碱性蛋白酶是具有可观工业潜力的清洁，皮革加工，银回收，医疗用途，食品加工，饲料和化学工业，以及废物处理的强大的酶。碱性蛋白酶如果在5℃的情况保存，只有一年的保质期；如果在25℃的情况下保藏，酶活的保质期不少于3个月。

1.1.2理化性质

碱性蛋白酶的最佳pH范围一般为pH 9到11。他们有很高的等电点，一般稳定在pH 6和pH 12^[2]。碱性蛋白酶的最佳温度范围是50~70℃。此外，一株来自嗜碱芽孢杆菌B189的碱性蛋白酶表现出极高的最适温度为85℃。碱性蛋白酶分子量大小的范围为15-30kDa，但也有少数的报告显示有的蛋白酶的分子量较高，达到31.6kDa，33kDa，36kDa等等。碱性蛋白酶需要像Ca2 ，Mg2 和Mn2 这样的二价阳离子或它们的组合，才能发挥最大的活性。据认为，这些阳离子在高温的情况下保护酶的构象，对酶的热变性和活性起到重要作用。Ca2 对碱性蛋白酶有稳定作用^[3]。苯甲基磺酰氟（PMSF）和二异丙基氟磷酸（DFP）是碱性蛋白酶的抑制剂。尽管碱性蛋白酶对许多合成基质和天然蛋白质都有活性，但是反应速度有很大不同。碱性蛋白酶对酪蛋白比对血红蛋白和牛血清蛋白的反应速度快。碱性蛋白酶的水解位点在肽链的中间，主要针对芳香族或疏水氨基酸残基^[4]。

1.1.3生产状况

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